SeekSoulTools — 单细胞转录组学一站式分析工具

生信菜鸟团

发布于 2024-07-10 08:46:10

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工欲善其事必先利其器

SeekSoulTools

SeekSoulTools 是寻因生物自主开发的一套处理单细胞转录组数据的软件，用于识别细胞标签barcode，比对定量，得到可用于下游分析的细胞表达矩阵，之后进行细胞聚类和差异分析，产品不仅支持SeekOne系列试剂盒产出数据，还可通过对barcode的描述，支持各种自定义设计结构。软件使用教程已经写的很好了，这边仅仅是作为知识的搬运工，记录一下测试体验过程。

官网：https://www.seekgene.com/fxrj
文档：http://seeksoul.seekgene.com/zh/v1.2.2/index.html

如何安装

下载安装包，解压即可使用

mkdir seeksoultools.1.2.2
cd seeksoultools.1.2.2
wget -c -O seeksoultools.1.2.2.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/seeksoultools/seeksoultools.1.2.2.tar.gz"

tar -xf seeksoultools.1.2.0.tar.gz

source ./bin/activate #激活conda环境

##测试是否可用
./seeksoultools --version

下载

功能简述

SeekSoulTools 目前包含四个模块，功能如下:

使用测试

下载测试数据和参考基因组

## rna模块测试数据
wget -c -O demo_dd.tar "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/demo_dd.tar"
#解压
tar xf demo_dd.tar -C demo_data
##下载参考基因组文件
wget -c -O GRCh38.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/GRCh38.tar.gz"
tar -zxvf GRCh38.tar.gz

##文件大小
 55G 8月  15  2023 demo_dd.tar
 11G 5月   8  2023 GRCh38.tar.gz

##解压后文件
28G 9月   7  2022 demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz
27G 9月   7  2022 demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz
##GRCh38
$tree -L 3
.
├── fasta
│   ├── genome.fa
│   └── genome.fa.fai
├── genes
│   └── genes.gtf
└── star
    ├── chrLength.txt
    ├── chrNameLength.txt
    ├── chrName.txt
    ├── chrStart.txt
    ├── exonGeTrInfo.tab
    ├── exonInfo.tab
    ├── geneInfo.tab
    ├── Genome
    ├── genomeParameters.txt
    ├── Log.out
    ├── SA
    ├── SAindex
    ├── sjdbInfo.txt
    ├── sjdbList.fromGTF.out.tab
    ├── sjdbList.out.tab
    └── transcriptInfo.tab

##fast模块测试数据
wget -c -O cellline.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/cellline.tar.gz"
#解压
tar zxf cellline.tar.gz -C fast_data
#下载rRNA参考基因组文件
wget -c -O hg38_rRNA.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/reference/hg38_rRNA.tar.gz"
tar -zxvf hg38_rRNA.tar.gz

##文件大小
45G 10月 24  2023 cellline.tar.gz
11G 5月  12  2023 hg38_rRNA.tar.gz

##解压后文件大小
22G 10月 23  2023 cellline_R1.fq.gz
23G 10月 23  2023 cellline_R2.fq.gz
##hg38_rRNA
$tree -L 3
.
├── genes
│   └── delete_rRNA5.8-18-28_in_rRNA45s.gtf
└── star
    ├── chrLength.txt
    ├── chrNameLength.txt
    ├── chrName.txt
    ├── chrStart.txt
    ├── exonGeTrInfo.tab
    ├── exonInfo.tab
    ├── geneInfo.tab
    ├── Genome
    ├── genomeParameters.txt
    ├── Log.out
    ├── SA
    ├── SAindex
    ├── sjdbInfo.txt
    ├── sjdbList.fromGTF.out.tab
    ├── sjdbList.out.tab
    └── transcriptInfo.tab


## vdj模块测试数据
wget -c -O PBMC_xin.tar "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/data/demodata/PBMC_xin.tar"
#解压
tar -xf PBMC_xin.tar -C vdj_data

##解压后文件大小
1.9G 3月   4 15:14 PBMC_xin_BCR_S19_L1_R1_001.fastq.gz
1.8G 3月   4 15:14 PBMC_xin_BCR_S19_L1_R2_001.fastq.gz
2.4G 3月   4 15:15 PBMC_xin_TCR_S19_L1_R1_001.fastq.gz
2.1G 3月   4 15:15 PBMC_xin_TCR_S19_L1_R2_001.fastq.gz

SeekSoulTools可以兼容CellRanger构建的参考基因组。可以直接使用10X的参考基因组，至于如何自己构建可参考：

不同物种的的10x单细胞转录组参考数据文件构建
制作非模式生物的单细胞参考基因组
http://seeksoul.seekgene.com/zh/v1.2.2/reference.html#ref-label

RNA模块

###将以下运行代码写入脚本 seeksoul_rna_run.sh

#! /bin/bash -xe
#

bin=/home/data/t020559/biosoft/seeksoultools.1.2.2/seeksoultools
ref=/home/data/t020559/seekone/GRCh38
ls ${bin} ; ls ${ref}

id=${1}

/usr/bin/time -v ${bin} rna run \
--fq1 /home/data/t020559/seekone/demo_data/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /home/data/t020559/seekone/demo_data/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--samplename ${id} \
--genomeDir ${ref}/star \
--gtf ${ref}/genes/genes.gtf \
--chemistry DDV2 \
--core 4 \
--include-introns

##参数释义
--fq1 #R1文件路径
--fq2 #R2文件路径
--samplename #样本名称。默认会在outdir创建以样本名命名的目录
--genomeDir #STAR构建的参考基因组路径, 版本需要与SeekSoulTools使用的STAR一致
--gtf #相应物种的gtf路径
--chemistry #试剂类型，每种对应一组--shift、--pattern、 --structure、--barcode和--sc5p的组合，可选值：DDV2，DD5V1，MM，MM-D；
            # DDV2 对应SeekOne® DD单细胞3’转录组试剂盒；
            # DD5V1 对应SeekOne® DD单细胞5’转录组试剂盒；
            # MM 对应SeekOne® MM单细胞转录组试剂盒；
            # MM-D 对应SeekOne® MM大孔径高通量转录组试剂盒
--core #设置线程
--include-introns #不启用时，只会选择exon reads⽤于定量；启用时，intron reads也会⽤于定量
--outdir #设定输出文件路径，默认值：./
--expectNum #预估的捕获细胞数目
--forceCell #当正常分析得到的细胞数⽬不理想时，选⽤此参数，后⾯加⼀个预期的数值N，SeekSoulTools软件会按照UMI从⾼到低取前N个细胞
--star_path #指定其他版本的STAR路径进行比对，版本需要与`--genomeDir`版本兼容，默认的`--star_path`为环境下的STAR

##提交任务
nohup bash seeksoul_rna_run.sh basic_test 1>log_test1.txt 2>&1 &

其余用法

如果一个样本对应多个FASTQ数据集，则输入文件依次指定即可，例如：

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L002_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L002_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--chemistry DDV2 \
--core 4 \
--include-introns

如果要使用SeekSoulTools自定义R1结构，则需使用--barcode 依次指定3段barcode，--linker依次指定2段linker ，例如：

seeksoultools rna run \
--fq1 /path/to/demo_dd_S39_L001_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /path/to/demo_dd_S39_L001_R2_001.fastq.gz \
--samplename demo \
--genomeDir /path/to/GRCh38/star \
--gtf /path/to/GRCh38/genes/genes.gtf \
--barcode /path/to/utils/CLS1.txt \
--barcode /path/to/utils/CLS2.txt \
--barcode /path/to/utils/CLS3.txt \
--linker /path/to/utils/Linker1.txt \
--linker /path/to/utils/Linker2.txt \
--structure B9L12B9L13B9U8 \
--core 4 \
--include-introns

barcode和UMI 以字母和数字描述Read1的基本结构，字母描述碱基含义，数字描述碱基长度

B: barcode部分碱基 L: linker部分碱基 U: UMI部分碱基 X: 其他任意碱基，用于占位

两种Read1结构示例

fast模块

###将以下运行代码写入脚本 seeksoul_fast_run.sh

#! /bin/bash -xe
#

bin=/home/data/t020559/biosoft/seeksoultools.1.2.2/seeksoultools
ref=/home/data/t020559/seekone/GRCh38
rRNA=/home/data/t020559/seekone/hg38_rRNA
ls ${bin} ; ls ${ref} ; ls ${rRNA}

id=${1}

/usr/bin/time -v ${bin} fast run \
--fq1 /home/data/t020559/seekone/fast_data/cellline_R1.fq.gz \
--fq2 /home/data/t020559/seekone/fast_data/cellline_R2.fq.gz \
--samplename ${id} \
--genomeDir ${ref}/star \
--gtf ${ref}/genes/genes.gtf \
--rRNAgenomeDir ${rRNA}/star \
--rRNAgtf ${rRNA}/genes/delete_rRNA5.8-18-28_in_rRNA45s.gtf \
--chemistry DD-Q \
--include-introns \
--core 4

### 参数释义
--rRNAgenomeDir #STAR构建的参考基因组路径,用于rRNA比例评估, 对于非人非鼠物种，该参数可以不指定，当不指定该参数时，用–genomeDir参数值进行核糖体信息统计。如果指定该参数吗，则版本需要与SeekSoulTools使用的STAR一致
--rRNAgtf #相应物种的gtf路径，用于rRNA比例评估，同样该参数可以不指定
--chemistry # 试剂类型；DD-Q 对应SeekOne® DD单细胞全序列转录组试剂盒
--scoremin #设置STAR比对时的`--outFilterScoreMinOverLread`参数，用于FFPE样本放宽比对要求
--matchnmin #设置STAR比对时的`--outFilterMatchNminOverLread`参数，用于FFPE样本放宽比对要求

##提交运行
nohup bash seeksoul_fast_run.sh fast_test 1>log_fast_test.txt 2>&1 &

如果是FFPE样本单细胞转录数据，可以添加参数 --scoremin 0.2 --matchnmin 0.33 使用

vdj模块

## T细胞分析
###将以下运行代码写入脚本 seeksoul_vdj_tcr_run.sh

#! /bin/bash -xe
#

bin=/home/data/t020559/biosoft/seeksoultools.1.2.2/seeksoultools
ls ${bin} 

id=${1}
output_dir=/home/data/t020559/seekone/TCR_test

if [ ! -d ${output_dir} ];
then mkdir -p ${output_dir}
fi

/usr/bin/time -v ${bin} vdj run \
--fq1 /home/data/t020559/seekone/vdj_data/PBMC_xin_TCR_S19_L1_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /home/data/t020559/seekone/vdj_data/PBMC_xin_TCR_S19_L1_R2_001.fastq.gz \
--chemistry DD5V1 \
--samplename ${id} \
--outdir ${output_dir} \
--chain TR \
--core 8  \
--organism human

## B细胞分析
###将以下运行代码写入脚本 seeksoul_vdj_bcr_run.sh

#! /bin/bash -xe
#

bin=/home/data/t020559/biosoft/seeksoultools.1.2.2/seeksoultools
ls ${bin} 

id=${1}
output_dir=/home/data/t020559/seekone/BCR_test

if [ ! -d ${output_dir} ];
then mkdir -p ${output_dir}
fi

/usr/bin/time -v ${bin} vdj run \
--fq1 /home/data/t020559/seekone/vdj_data/PBMC_xin_BCR_S19_L1_R1_001.fastq.gz \
--fq2 /home/data/t020559/seekone/vdj_data/PBMC_xin_BCR_S19_L1_R2_001.fastq.gz \
--chemistry DD5V1 \
--samplename ${id} \
--outdir ${output_dir} \
--chain IG \
--core 8  \
--organism human

###参数释义
--organism #设定物种。可选值：human，mouse， monkey，rabbit，rat
--chain #链类型，可选值：IG，TR；IG对应B细胞受体；TR对应T细胞受体


##提交运行
nohup bash seeksoul_vdj_tcr_run.sh PBMC_xin_TCR 1>log_test2_tcr.txt 2>&1 &
nohup bash seeksoul_vdj_bcr_run.sh PBMC_xin_BCR 1>log_test2_bcr.txt 2>&1 &