cellranger multi—手把手教你单细胞免疫组库定量

生信菜鸟团

发布于 2025-03-18 20:33:20

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工欲善其事必先利其器

单细胞免疫组库

单细胞免疫组库 是一种基于单细胞测序技术的高精度研究方法，用于解析免疫细胞（如T细胞、B细胞）的抗原受体（TCR/BCR）序列及其转录组特征。传统bulk测序无法揭示细胞异质性，而单细胞技术可精准识别克隆型分布、分化轨迹及功能状态，为免疫机制研究提供分子级分辨率。

10X Genomics 通过其Chromium平台开发了专为免疫组库设计的解决方案（如10x Chromium Single-Cell V(D)J Assay），可在单细胞层面同时获取全长配对 V (D) J 序列、基因表达、细胞表面蛋白表达和抗原特异性数据。该检测方法将数千个细胞分隔到乳液包裹凝胶微珠（GEMs）中，单个液滴内生成的所有互补 DNA（cDNA）都具有相同的 10X Barcode。从 cDNA 构建文库并进行测序，根据10X Barcode将每条读取的序列追溯到其对应的单个cell，实现大规模单细胞水平免疫受体库的深度解析，支持克隆演化、抗原特异性响应及免疫治疗靶点发现。

分析环境

同10X单细胞转录组，10X Genomics 也提供了完善的分析 pipeline 。

https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest/analysis/running-pipelines/cr-5p-multi

首先用的软件还是 cellranger ,前面也多次介绍，并且共享服务器也有提供现成的软件和参考基因组，可以直接调用。【服务器详情见：满足你生信分析计算需求的低价解决方案】

共享服务器

如果需要自己下载，也可以直接在官网下载：

https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/downloads

wget -O cellranger-9.0.1.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-9.0.1.tar.gz?Expires=1742333081&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=aSXlUageSwcEjNHFjw6JGYuf6ccW7AAe5uVmOJ4YrH~fX28OCPGGb4q5pJ7tFYSSvz6f4vv-35D0G4tOLIvG7ptV8k8EQhjVFnVzU9OEY4yZ1qPNVcB0UR~qnRvego4~diZrKz0covGULCVNf~l4lmnPtlNnbM7Z2O4A2~x~2be3peRTchZ4eLC7PUJhVFFHPABx4fVqlMabd6g2wabJQuuxg37r1uXuxoOim3YlOs2lbN4Nm~LTpZ6BdK3M7-Ai9AOMCmwmut41mi-h32rJgZT9M0Ga~LpKatCgOysCHkwCQNe-CNyv1X~h44ipI18NCpvxoSN3VVJbb8SHzVQgBg__"

其次是所需的参考基因组文件

#human 
wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz"
wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-vdj/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-7.1.0.tar.gz"

免疫组库定量

定量脚本

根据官方文档，我们可以很容易写出我们所需的定量脚本：

$cat ~/scRNAseq_pipeline/st3_cellranger9_vdj_multi.sh
#! /bin/bash -xe
#

bin=/home/username/software/cellranger-9.0.1/cellranger

/usr/bin/time -v $bin multi --id=${1} \
--csv=${2} \
--localcores=4 \
--localmem=50

准备输入文件

从定量脚本，可以看出对于整个pipeline最主要的就是准备一个样本信息的csv文件。根据文档信息：

https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest/analysis/running-pipelines/cr-5p-multi

如果少量样本，我们按示例格式手动修改即可。例如：

$cat C1008587.csv
[gene-expression]
reference,/home/username/reference/human/refdata-gex-GRCh38-2024-A
create-bam,false

[vdj]
reference,/home/username/reference/human/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-7.1.0

[libraries]
fastq_id,fastqs,feature_types
C1008587,/home/username/project/b_scrna,Gene Expression
C1008587_BCR,/home/username/project/b_rawdata/C1008587_BCR,VDJ-B
C1008587_TCR,/home/username/project/b_rawdata/C1008587_TCR,VDJ-T

提交定量任务

## 单样本提交后台
nohup bash /home/usernam/scRNAseq_pipeline/st3_cellranger9_vdj_multi.sh C1008587 /home/usernam/project/cellrgr9/C1008587.csv 1>log_C1008587.txt 2>&1 &

多样本批处理

如果有多个样本，那么再手动逐一修改csv文件就会显得很低效了。这时候就需要考虑如何快速批量生成样本对应的csv文件。

这边提供一个思路是：

对应每个样本的csv文件我们需要变动的地方也只是libraries
先做一个头文件
批量生成后面的信息，最后合并成一个完整的csv文件

首先根据自己的参考基因组和vdj参考文件新建一个head.txt

$cat head.txt 
[gene-expression]
reference,/home/username/reference/human/refdata-gex-GRCh38-2024-A
create-bam,false

[vdj]
reference,/home/username/reference/human/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-7.1.0

[libraries]
fastq_id,fastqs,feature_types

然后批量生成csv文件后半部分样品信息：

前提条件：

文件名符合cellranger要求
所有样本的表达量数据在同一个目录下
每个样本的BCR、TCR数据分别在单独的子目录

GEX数据目录结构示例：

GEX数据

BCR\TCR目录结构示例：

BCR、TCR数据

根据gz文件目录结构信息，批量创建样本的csv文件，脚本命名为generate_csv.sh

$cat generate_csv.sh 
#!/bin/bash
#

#Define variables
gex_gz=~/project/b_scrna/*gz
bcr_gz=~/project/b_rawdata/*BCR*/*BCR*.gz
tcr_gz=~/project/b_rawdata/*TCR*/*TCR*.gz
headfile=~/project/b_scrna/head.txt 
out_dir=~/project/c_multi_outs

#GEX data
ls ${gex_gz}|grep -E -v "BCR|TCR"|awk -F'/' '
{
    full_dir_path = $0
    sub(/\/[^\/]+$/, "", full_dir_path)
    split($NF, parts, "_S1")
    print parts[1] "," full_dir_path
}'|sort -u|awk '{print $0 ",Gene Expression"}'  > ge_data.txt 

#BCR data
ls ${bcr_gz} | awk -F'/' '
{
    full_dir_path = $0
    sub(/\/[^\/]+$/, "", full_dir_path)
    split($NF, parts, "_S1")
    print parts[1] "," full_dir_path
}'|sort -u|awk '{print $0 ",VDJ-B"}' > bcr_data.txt

#TCR data
ls ${tcr_gz} | awk -F'/' '
{
    full_dir_path = $0
    sub(/\/[^\/]+$/, "", full_dir_path)
    split($NF, parts, "_S1")
    print parts[1] "," full_dir_path
}'|sort -u|awk '{print $0 ",VDJ-T"}' > tcr_data.txt


paste ge_data.txt bcr_data.txt tcr_data.txt > data_list.txt

# Check whether the head file exists
if [ ! -f ${headfile} ]; then
    echo "head file does not exist."
    exit 1
fi

#Create a CSV file of each sample
cat data_list.txt |while read id; do
    sample=$(echo "$id" | cut -d "," -f 1)
    cp ${headfile} ${out_dir}/${sample}.csv
    printf "%s\n" "$id" | xargs -n 1 -d "\t" >> ${out_dir}/${sample}.csv
done

## Delete temporary files
rm data_list.txt ge_data.txt bcr_data.txt tcr_data.txt

echo "All CSV files have been generated."

注：不一定适合所有情况，可根据自己数据的目录结构修改脚本。上述代码不是最优解，也可自己重写。

每个样本一个csv文件

检查CSV文件，确保符合程序要求。

$cat C1008587.csv
[gene-expression]
reference,/home/username/reference/human/refdata-gex-GRCh38-2024-A
create-bam,false

[vdj]
reference,/home/username/reference/human/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-7.1.0

[libraries]
fastq_id,fastqs,feature_types
C1008587,/home/username/project/b_scrna,Gene Expression
C1008587_BCR,/home/username/project/b_rawdata/C1008587_BCR,VDJ-B
C1008587_TCR,/home/username/project/b_rawdata/C1008587_TCR,VDJ-T

$cat C1010319.csv
[gene-expression]
reference,/home/username/reference/human/refdata-gex-GRCh38-2024-A
create-bam,false

[vdj]
reference,/home/username/reference/human/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-7.1.0

[libraries]
fastq_id,fastqs,feature_types
C1010319,/home/username/project/b_scrna,Gene Expression
C1010319_BCR,/home/username/project/b_rawdata/C1010319_BCR,VDJ-B
C1010319_TCR,/home/username/project/b_rawdata/C1010319_TCR,VDJ-T

批量提交后台任务

提交任务的时候需要根据服务器可用资源来调整调用的内存和线程，以及是分批提交，还是一次性全部提交。

##多样本分批执行
ls *.csv|cut -d "." -f 1 |awk '{print "bash /home/username/scRNAseq_pipeline/st3_cellranger9_vdj_multi.sh " $1 " /home/username/project/c_multi_outs/"$1".csv 1>log_"$1".txt 2>&1"}'  > screen_run.sh

screen -R vdj
cat screen_run.sh |xargs -iF -P 3 sh -c "F"

结果输出

正常运行结束，每个样本ID目录下面会有一个outs目录，outs目录里面就是我们需要的结果文件。

$tree -L 5
.
├── config.csv
├── multi
│   ├── count
│   │   ├── raw_cloupe.cloupe
│   │   ├── raw_feature_bc_matrix
│   │   │   ├── barcodes.tsv.gz
│   │   │   ├── features.tsv.gz
│   │   │   └── matrix.mtx.gz
│   │   ├── raw_feature_bc_matrix.h5
│   │   └── raw_molecule_info.h5
│   ├── vdj_b
│   │   ├── all_contig_annotations.bed
│   │   ├── all_contig_annotations.csv
│   │   ├── all_contig_annotations.json
│   │   ├── all_contig.bam
│   │   ├── all_contig.bam.bai
│   │   ├── all_contig.fasta
│   │   ├── all_contig.fasta.fai
│   │   └── all_contig.fastq
│   └── vdj_t
│       ├── all_contig_annotations.bed
│       ├── all_contig_annotations.csv
│       ├── all_contig_annotations.json
│       ├── all_contig.bam
│       ├── all_contig.bam.bai
│       ├── all_contig.fasta
│       ├── all_contig.fasta.fai
│       └── all_contig.fastq
├── per_sample_outs
│   └── C1008587
│       ├── count
│       │   ├── analysis
│       │   │   ├── clustering
│       │   │   ├── diffexp
│       │   │   ├── pca
│       │   │   ├── tsne
│       │   │   └── umap
│       │   ├── sample_cloupe.cloupe
│       │   ├── sample_filtered_barcodes.csv
│       │   ├── sample_filtered_feature_bc_matrix
│       │   │   ├── barcodes.tsv.gz
│       │   │   ├── features.tsv.gz
│       │   │   └── matrix.mtx.gz
│       │   ├── sample_filtered_feature_bc_matrix.h5
│       │   └── sample_molecule_info.h5
│       ├── metrics_summary.csv
│       ├── vdj_b
│       │   ├── airr_rearrangement.tsv
│       │   ├── cell_barcodes.json
│       │   ├── clonotypes.csv
│       │   ├── concat_ref.bam
│       │   ├── concat_ref.bam.bai
│       │   ├── concat_ref.fasta
│       │   ├── concat_ref.fasta.fai
│       │   ├── consensus_annotations.csv
│       │   ├── consensus.bam
│       │   ├── consensus.bam.bai
│       │   ├── consensus.fasta
│       │   ├── consensus.fasta.fai
│       │   ├── donor_regions.fa
│       │   ├── filtered_contig_annotations.csv
│       │   ├── filtered_contig.fasta
│       │   ├── filtered_contig.fastq
│       │   ├── vdj_contig_info.pb
│       │   └── vloupe.vloupe
│       ├── vdj_t
│       │   ├── airr_rearrangement.tsv
│       │   ├── cell_barcodes.json
│       │   ├── clonotypes.csv
│       │   ├── concat_ref.bam
│       │   ├── concat_ref.bam.bai
│       │   ├── concat_ref.fasta
│       │   ├── concat_ref.fasta.fai
│       │   ├── consensus_annotations.csv
│       │   ├── consensus.bam
│       │   ├── consensus.bam.bai
│       │   ├── consensus.fasta
│       │   ├── consensus.fasta.fai
│       │   ├── donor_regions.fa
│       │   ├── filtered_contig_annotations.csv
│       │   ├── filtered_contig.fasta
│       │   ├── filtered_contig.fastq
│       │   ├── vdj_contig_info.pb
│       │   └── vloupe.vloupe
│       └── web_summary.html
└── vdj_reference
    ├── fasta
    │   └── regions.fa
    └── reference.json

19 directories, 70 files

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原始发表：2025-03-18，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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