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社区首页 >专栏 >Cibersort免疫浸润的在线分析及R语言代码实现

Cibersort免疫浸润的在线分析及R语言代码实现

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生信宝典
发布于 2022-01-18 11:41:11
发布于 2022-01-18 11:41:11
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上期展示了ESITMATE(基于转录组数据)计算免疫得分和肿瘤纯度的一个例子,详见ggplot2实现分半小提琴图绘制基因表达谱和免疫得分。实际上计算肿瘤纯度的方法还有InfiniumPurify(基于甲基化数据)、ABSOLUTE(基于体细胞拷贝数变异)、PurityEst(基于突变数据)等等,而计算免疫浸润的有CibersortssGSEATIMER等算法。

本期我们介绍一下简单易上手的Cibersort算法。CIBERSORTx(https://cibersortx.stanford.edu/)是Newman等人开发的一种分析工具,可基于基因表达数据估算免疫细胞的丰度:

本文主要从以下两个模块进行介绍:

一. Cibersort算法的纯代码实现及结果绘图展示;

二. Cibersort算法的网页版实现。

在模块一绘图部分,笔者还根据一篇文献,将得到的免疫细胞分为4大类Total lymphocytesTotal dendritic cellTotal macrophageTotal mast cell

沿用前几期的示例数据,本期使用的还是TCGA头颈癌的43对癌和癌旁FPKM数据。参考文献《Profiling tumor infiltrating immune cells with CIBERSORT》,可知Cibersort对于输入数据的要求如下:

值得注意的是,虽然文献建议输入数据要求是non-log linear space,但是检查Cibersort可看到有一段函数if(max(Y) < 50) {Y <- 2^Y}(见模块一的源代码),专门用于检测输入数据是否为log化后的输入数据,如果是(max < 50),则会自动还原为log前的数据。因此,用户不必纠结于log与否。

总结来说,输入数据是芯片数据还是RNA-seq数据都可以,RNA-seq数据不建议直接使用Count,应使用FPKMTPMDESEq2标准化后的矩阵为宜。

但输入数据的基因名字需要为Gene symbol

注意不能有重复的基因名和缺失/负值数据,其他具体的一些细节,还是需要用户去浏览上面那篇文献。

如何处理重复的基因名,如何得到TCGA的FPKM数据,可以参考前几期的推文,利用R代码从UCSC XENA下载mRNA, lncRNA, miRNA表达数据并匹配临床信息

模块一. Cibersort算法的纯代码实现及结果绘图展示

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remove(list = ls()) #一键清空
#加载包
library(ggplot2)
library(reshape2)
library(ggpubr)
library(dplyr)

1. Cibersort计算免疫细胞

加载cibersort的官方提供的源码,指定基准数据库文件 (LM22.txt,这是22种免疫细胞的marker基因,下载自Cibersort官网)。

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source('./assist/Cibersort.R')

# 设置分析依赖的基础表达文件
# 每类免疫细胞的标志性基因及其表达
# 基因名字为Gene symbol
LM22.file <- "./database/LM22.txt"

加载自己的数据用于分析计算免疫细胞

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# 1. Cibersort

TCGA_exp.file <- "./Rawdata/TCGA_HNSC_mRNA_fpkm_paired_43vs43.txt"

TCGA_TME.results <- CIBERSORT(LM22.file ,TCGA_exp.file, perm = 50, QN = F)  
# perm置换次数=1000
# QN如果是芯片设置为T,如果是测序就设置为F

write.csv(TCGA_TME.results, "./Output/TCGA_CIBERSORT_Results_fromRcode.csv")

Permutations for significance analysis是用来计算单个样本估算免疫浸润的p值,大多数文章会采用1000次。数值越大,运行时间越久,这里笔者为了加速运行的速度,选择了50次 (笔记本运行耗时5分钟)。

2. 分组信息

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## 2. 分组信息

# TCGA的数据还可以从名字获取
# group_list <- ifelse(as.numeric(substring(rownames(TCGA_TME.results),14,15)) < 10,
#                    "Tumor","Normal") %>% 
#  factor(.,levels = c("Normal","Tumor"))

phenotype = read.csv("./Rawdata/TCGA_HNSC_paired_metadata.csv",header = T,row.names = 1)

group_list <- phenotype$group %>% 
  factor(.,levels = c("Nontumor","Tumor"))

table(group_list) # Normal 43   Tumor 43 

## group_list
## Nontumor    Tumor 
##       43       43

3. 绘图

3.1 数据转换预处理,取前22列,忽略掉后面计算出的P-value,Correlation, RMSE单列信息。

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## 3. 绘图
  # 3.1 数据粗处理
TME_data <- as.data.frame(TCGA_TME.results[,1:22])

TME_data$group <- group_list
TME_data$sample <- row.names(TME_data)

  # 2.2 融合数据
TME_New = melt(TME_data)

## Using group, sample as id variables

colnames(TME_New)=c("Group","Sample","Celltype","Composition")  #设置行名
head(TME_New)

##      Group          Sample      Celltype Composition
## 1    Tumor TCGA.CV.6943.01 B cells naive 0.007651678
## 2    Tumor TCGA.CV.6959.01 B cells naive 0.019549031
## 3 Nontumor TCGA.CV.7438.11 B cells naive 0.025349204
## 4 Nontumor TCGA.CV.7242.11 B cells naive 0.032583659
## 5    Tumor TCGA.CV.7432.01 B cells naive 0.000000000
## 6 Nontumor TCGA.CV.6939.11 B cells naive 0.074282293

3.2 按免疫细胞占比中位数排序绘图(可选)

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  # 3.3 按免疫细胞占比中位数排序绘图(可选)
plot_order = TME_New[TME_New$Group=="Tumor",] %>% 
  group_by(Celltype) %>% 
  summarise(m = median(Composition)) %>% 
  arrange(desc(m)) %>% 
  pull(Celltype)

## `summarise()` ungrouping output (override with `.groups` argument)

TME_New$Celltype = factor(TME_New$Celltype,levels = plot_order)

3.3 绘制箱线图

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# 3.3 出图
if(T){
  mytheme <- theme(plot.title = element_text(size = 12,color="black",hjust = 0.5),
                   axis.title = element_text(size = 12,color ="black"), 
                   axis.text = element_text(size= 12,color = "black"),
                   panel.grid.minor.y = element_blank(),
                   panel.grid.minor.x = element_blank(),
                   axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1 ),
                   panel.grid=element_blank(),
                   legend.position = "top",
                   legend.text = element_text(size= 12),
                   legend.title= element_text(size= 12)
  ) }

box_TME <- ggplot(TME_New, aes(x = Celltype, y = Composition))+ 
  labs(y="Cell composition",x= NULL,title = "TME Cell composition")+  
  geom_boxplot(aes(fill = Group),position=position_dodge(0.5),width=0.5,outlier.alpha = 0)+ 
  scale_fill_manual(values = c("#1CB4B8", "#EB7369"))+
  theme_classic() + mytheme + 
  stat_compare_means(aes(group =  Group),
                     label = "p.signif",
                     method = "wilcox.test",
                     hide.ns = T)

box_TME;ggsave("./Output/TCGA_HNSCC_TME.pdf",box_TME,height=15,width=25,unit="cm")

除了常规的结果展示,笔者还看到有一篇文献《The Immune Subtypes and Landscape of Squamous Cell Carcinoma》,将Cibersort计算得到的20类免疫细胞大致分为4大类:Total lymphocytesTotal dendritic cellTotal macrophageTotal mast cell。此外,还计算了M1/M2巨噬细胞的比例。方法部分的描述如下:

4.1. 提取文献用到的前20种免疫细胞

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##
  # 4.120种免疫细胞
TCGA_TME_four = as.data.frame(TCGA_TME.results[,1:20])
head(TCGA_TME_four,3)

##                 B cells naive B cells memory Plasma cells T cells CD8 T cells CD4 naive
## TCGA.CV.6943.01   0.007651678     0.00000000   0.04249975  0.33831313                 0
## TCGA.CV.6959.01   0.019549031     0.00000000   0.05950866  0.03842026                 0
## TCGA.CV.7438.11   0.025349204     0.01107915   0.06419163  0.14099744                 0
##                 T cells CD4 memory resting T cells CD4 memory activated T cells follicular helper
## TCGA.CV.6943.01                 0.00000000                   0.06796614                0.03913214
## TCGA.CV.6959.01                 0.11798455                   0.07211551                0.00000000
## TCGA.CV.7438.11                 0.06486108                   0.03390592                0.07309813
##                 T cells regulatory (Tregs) T cells gamma delta NK cells resting NK cells activated
## TCGA.CV.6943.01                 0.05035414          0.00000000      0.007625709        0.000000000
## TCGA.CV.6959.01                 0.00000000          0.00000000      0.037617016        0.001607423
## TCGA.CV.7438.11                 0.04039972          0.02312377      0.000000000        0.030996791
##                 Monocytes Macrophages M0 Macrophages M1 Macrophages M2 Dendritic cells resting
## TCGA.CV.6943.01         0     0.04310127      0.2272938     0.08760478             0.010476052
## TCGA.CV.6959.01         0     0.29903927      0.1140220     0.08606996             0.008655281
## TCGA.CV.7438.11         0     0.12215035      0.1099711     0.05154016             0.104453345
##                 Dendritic cells activated Mast cells resting Mast cells activated
## TCGA.CV.6943.01                0.00000000         0.07769942            0.0000000
## TCGA.CV.6959.01                0.03261665         0.00000000            0.0919163
## TCGA.CV.7438.11                0.03317884         0.06982843            0.0000000

4.2 根据文献整理得到的免疫细胞分类

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  # 4.2 根据文献整理得到的免疫细胞分类
immCell_four_type <- read.table("./database/Cibersort_four_types.txt", header = T, row.names = NULL, sep = "\t")
colnames(TCGA_TME_four) == immCell_four_type$Immune.cells #T

##  [1] TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE

head(immCell_four_type)

##                 Immune.cells       Types
## 1              B cells naive Lymphocytes
## 2             B cells memory Lymphocytes
## 3               Plasma cells Lymphocytes
## 4                T cells CD8 Lymphocytes
## 5          T cells CD4 naive Lymphocytes
## 6 T cells CD4 memory resting Lymphocytes

4.3 计算每一个大类的免疫得分

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  # 4.3 数据预处理
TCGA_TME_four$group = group_list
TCGA_TME_four$sample <- row.names(TCGA_TME_four)
TME_four_new = melt(TCGA_TME_four)

## Using group, sample as id variables

colnames(TME_four_new) = c("Group","Sample","Immune.cells","Composition")

TCGA_TME_four_new2 = left_join(TME_four_new, immCell_four_type, by = "Immune.cells") %>% 
                group_by(Sample,Group,Types) %>%
                summarize(Sum = sum(Composition))

## `summarise()` regrouping output by 'Sample', 'Group' (override with `.groups` argument)

  # 出图
box_four_immtypes <- ggplot(TCGA_TME_four_new2, aes(x = Group, y = Sum))+ 
  labs(y="Cell composition",x= NULL,title = "TCGA")+  
  geom_boxplot(aes(fill = Group),position=position_dodge(0.5),width=0.5,size=0.4,
               outlier.alpha = 1, outlier.size = 0.5)+ 
  theme_bw() + mytheme + 
  scale_fill_manual(values = c("#1CB4B8","#EB7369"))+ 
  scale_y_continuous(labels = scales::percent)+
  facet_wrap(~ Types,scales = "free",ncol = 4) + 
  stat_compare_means(aes(group =  Group),
                     label = "p.format",
                     method = "wilcox.test",
                     size = 3.5,
                     hide.ns = T)
box_four_immtypes;ggsave("./Output/TCHA_HNSC_Cibersort_four_immune_cell_types.pdf",
                         box_four_immtypes ,height= 10,width=25,unit="cm")

模块二. Cibersort网页版实现

网页版和代码版输出的结果是等价的。区别在于用R代码运行Cibersort非常耗时,但胜在比较自由方便;而网页版的好处在于在线运行数据,上传和运行之后,即使关闭网页也能拿到数据,缺点在于网页版不太稳定,网络不好的时候很难登录和使用。

笔者再介绍一下网页版的使用步骤:

首先是注册和登录,登录网址是https://cibersortx.stanford.edu/,注册需要edu的邮箱。

第二步是上传数据,如下图所示,点击Menu—Upload files—Add files上传txt数据,数据格式详见示例数据。

第三步,配置参数,准备运行,点击Menu—Run CIBERSORTx—2.Impute Cell Fractions,具体的配置如下:

和代码版的一样,为了加速运行的速度,Permutations for significance analysis这里选择了50次:

第四步,运行一段时间之后,可以看到结果,Menu—Job Results,点击CSV或者XLSX可得到预测的结果,即为模块一的输出数据。

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sessionInfo()

## R version 4.0.4 (2021-02-15)
## Platform: x86_64-w64-mingw32/x64 (64-bit)
## Running under: Windows 7 x64 (build 7601) Service Pack 1
## 
## Matrix products: default
## 
## locale:
## [1] LC_COLLATE=Chinese (Simplified)_People's Republic of China.936 
## [2] LC_CTYPE=Chinese (Simplified)_People's Republic of China.936   
## [3] LC_MONETARY=Chinese (Simplified)_People's Republic of China.936
## [4] LC_NUMERIC=C                                                   
## [5] LC_TIME=Chinese (Simplified)_People's Republic of China.936    
## 
## attached base packages:
## [1] parallel  stats     graphics  grDevices utils     datasets  methods   base     
## 
## other attached packages:
## [1] preprocessCore_1.50.0 e1071_1.7-3           dplyr_1.0.0           ggpubr_0.4.0         
## [5] reshape2_1.4.4        ggplot2_3.3.2        
## 
## loaded via a namespace (and not attached):
##  [1] tinytex_0.24      tidyselect_1.1.0  xfun_0.15         purrr_0.3.4       haven_2.3.1      
##  [6] carData_3.0-4     colorspace_1.4-1  vctrs_0.3.1       generics_0.1.0    htmltools_0.5.0  
## [11] yaml_2.2.1        rlang_0.4.6       pillar_1.4.6      foreign_0.8-80    glue_1.4.1       
## [16] withr_2.2.0       readxl_1.3.1      lifecycle_0.2.0   plyr_1.8.6        stringr_1.4.0    
## [21] munsell_0.5.0     ggsignif_0.6.0    gtable_0.3.0      cellranger_1.1.0  zip_2.1.1        
## [26] evaluate_0.14     labeling_0.3      knitr_1.29        rio_0.5.16        forcats_0.5.0    
## [31] class_7.3-17      curl_4.3          fansi_0.4.1       broom_0.7.0       Rcpp_1.0.5       
## [36] scales_1.1.1      backports_1.1.7   abind_1.4-5       farver_2.0.3      hms_0.5.3        
## [41] digest_0.6.25     stringi_1.4.6     openxlsx_4.1.5    rstatix_0.6.0     grid_4.0.2       
## [46] cli_2.0.2         tools_4.0.2       magrittr_1.5      tibble_3.0.2      crayon_1.3.4     
## [51] tidyr_1.1.0       car_3.0-8         pkgconfig_2.0.3   ellipsis_0.3.1    data.table_1.12.8
## [56] assertthat_0.2.1  rmarkdown_2.7     rstudioapi_0.11   R6_2.4.1          igraph_1.2.5     
## [61] compiler_4.0.2

参考资料:

  1. Newman AM, Steen CB, Liu CL, Gentles AJ, Chaudhuri AA, Scherer F, Khodadoust MS, Esfahani MS, Luca BA, Steiner D, Diehn M, Alizadeh AA. Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nat Biotechnol. 2019 Jul;37(7):773-782. doi: 10.1038/s41587-019-0114-2. Epub 2019 May 6. PMID: 31061481; PMCID: PMC6610714.
  2. Chen B, Khodadoust MS, Liu CL, Newman AM, Alizadeh AA. Profiling Tumor Infiltrating Immune Cells with CIBERSORT. Methods Mol Biol. 2018;1711:243-259. doi: 10.1007/978-1-4939-7493-1_12. PMID: 29344893; PMCID: PMC5895181.
  3. Li B, Cui Y, Nambiar DK, Sunwoo JB, Li R. The Immune Subtypes and Landscape of Squamous Cell Carcinoma. Clin Cancer Res. 2019 Jun 15;25(12):3528-3537. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-4085. Epub 2019 Mar 4. PMID: 30833271; PMCID: PMC6571041.
  4. 数据和代码下载: https://gitee.com/ct5869/shengxin-baodian/tree/master/TCGA
  5. 作者:赵法明 编辑:生信宝典
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原始发表:2021-05-13,如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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用户6317549
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免疫浸润一直是生信数据挖掘的重点,免疫浸润的各种算法也是大家学习生信数据挖掘必学的知识点。
医学和生信笔记
2023/08/30
1.4K1
1行代码完成8种免疫浸润分析
tigeR免疫治疗数据分析工具学习和整理
该工具内置了 11 个黑色素瘤数据集、3 个肺癌数据集、2 个肾癌数据集、1 个胃癌数据集、1 个低级别胶质瘤数据集、1 个胶质母细胞瘤数据集和 1 个头颈鳞状细胞癌数据集的 1060 例具有免疫治疗临床信息的样本。23个重要的免疫治疗反应相关的生物标志物。10种TME去积卷方法工具和7种机器学习算法。
凑齐六个字吧
2024/10/15
2580
tigeR免疫治疗数据分析工具学习和整理
转录组8种免疫浸润分析方法整理
探索疾病的免疫微环境是当下研究的热点,因此这也要求我们对免疫浸润分析的各种工具要有所了解,这些工具包括: CIBERSORT,quanTIseq,EPIC (这三种方法可得到不同细胞亚群的百分比结果/绝对丰度), xCell,TIMER,MCPcounter,ImmuCellAI (这四种方法可得到相对丰度),ESTIMATE (用于进行基质、免疫、Estimate和肿瘤纯度评分)等。
凑齐六个字吧
2024/08/17
1.9K0
转录组8种免疫浸润分析方法整理
胰腺导管腺癌免疫细胞浸润及其临床意义
导管腺癌及其亚型是最常见的胰腺肿瘤,占胰腺肿瘤的85%~90%。大多数发展中国家的发病率为1~10人/万。由于胰腺癌的生存率极低,发病率和死亡率几乎是相等的。肿瘤免疫细胞浸润是指免疫细胞从血液中移向肿瘤组织,开始发挥它的作用。肿瘤中免疫细胞的浸润与临床结果密切相关,肿瘤中浸润的免疫细胞最有可能作为药物靶标来提高患者的生存率。
作图丫
2022/03/29
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胰腺导管腺癌免疫细胞浸润及其临床意义
ProTICS 揭示了不同分子亚型中肿瘤浸润免疫细胞的预后影响
这是生信技能树知识整理工作的第2个文档,前面的是:基于支持向量机模型的TNBC的分子亚型预测
生信技能树
2022/07/26
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ProTICS 揭示了不同分子亚型中肿瘤浸润免疫细胞的预后影响
ggplot2实现分半小提琴图绘制基因表达谱和免疫得分
最近看到很多人问下面这个图怎么绘制,看着确实不错。于是我查了一些资料,这个图叫split violin或者half violin,本质上是一种小提琴图。参考代码在https://gist.github.com/Karel-Kroeze/746685f5613e01ba820a31e57f87ec87
生信宝典
2021/04/15
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RNAseq|免疫浸润也杀疯了,cibersoert?xCELL?ESTIMATE?你常用哪一个
肿瘤免疫浸润分析是一个文献中的网红分析内容,分析软件有很多,本次先介绍一下cibersort ,xCELL 和 ESTIMATE ,这几款软件在文章中的出镜率都很高 。
生信补给站
2023/03/08
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RNAseq|免疫浸润也杀疯了,cibersoert?xCELL?ESTIMATE?你常用哪一个
小鼠免疫微环境分析方法调研
目前,越来越多的研究者通过构建小鼠疾病或者癌症模型,研究癌症发病机制。因此,对小鼠免疫微环境分析需求越来越多。所有检测不同细胞类型所占比例的方法主要原理是,构建特征基因集,然后利用机器学习方法或者反卷积方法对所测RNA-seq数据进行分析,确定其不同细胞类型比例,因此这种方法也对阈值选择比较敏感。
生信技能树
2021/11/23
2K1
肿瘤微环境看基质和免疫细胞就太泛了
实际上, 这个方法还是过于粗糙了,肿瘤微环境的复杂程度,远不止基质和免疫细胞简单的归类。我随手查了一个比较新的综述文章:《Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance》,链接是https://biosignaling.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12964-020-0530-4,感兴趣的可以自己研读:
生信技能树
2021/10/12
1.1K0
免疫浸润分析方法知多少
肿瘤不是单纯的恶性细胞群,而是由不同类型细胞组成的复杂生态系统。在这些细胞中,肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤控制和治疗反应中起着核心作用。例如,细胞毒性CD8 + T细胞是抗癌免疫的主要效应因子,因为它们可以特异性地识别和杀死携带新抗原的肿瘤细胞。肿瘤特异性抗原主要来源于突变基因的表达。但免疫细胞也可以发挥免疫抑制作用,支持肿瘤发生和免疫逃避,如调节性T细胞。
作图丫
2022/03/29
1.3K0
免疫浸润分析方法知多少
9步骤完成单细胞数据挖掘文章全部图表复现
文章图表复现: Integration of scRNA-Seq and Bulk RNA-Seq to Analyse the Heterogeneity of Ovarian Cancer Immune Cells and Establish a Molecular Risk Model
生信技能树jimmy
2023/08/31
1.2K0
9步骤完成单细胞数据挖掘文章全部图表复现
泛癌水平的批量生存分析
都是依据肿瘤病人的转录组测序表达量矩阵进行的分析,也有几百篇类似的数据挖掘文章了,它们总是喜欢落脚到estimate或者CIBERSORT结果的预后意义。但是实际上我们也代码演示了:estimate或者CIBERSORT结果真的是很好的临床预后指标吗,这样做风险很大,后面留了一个思考题,就是CIBERSORT的22种免疫细胞比例的生存意义的全部癌症的探索,呼应我们的主题《泛癌水平的批量生存分析》。
生信技能树
2021/10/21
1.5K0
泛癌水平的批量生存分析
肿瘤免疫细胞浸润与临床相关性分析
Profiles of immune infiltration in colorectal cancer and theirclinical significant: A gene expression- based study
DoubleHelix
2020/04/07
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单细胞文章复现-抗PD-1免疫治疗联合雄激素剥夺治疗可诱导转移性去势敏感前列腺癌的强免疫浸润
首先下载数据 https://data.mendeley.com/datasets/5nnw8xrh5m/1
生信菜鸟团
2023/12/12
4060
单细胞文章复现-抗PD-1免疫治疗联合雄激素剥夺治疗可诱导转移性去势敏感前列腺癌的强免疫浸润
你不会以为它们的免疫评分都是自己算的吧
但是接下来大家又想问,同样的想比较两个分组的免疫评分的差异,但是免疫评分的工具太多了,比如有一个2019的综述文章:《Comprehensive evaluation of transcriptome-based cell-type quantification methods for immuno-oncology》比较了常见的免疫细胞比例推断工具的表现,另外一个2018的综述《Quantifying tumor-infiltrating immune cells from transcriptomics data》提到工具更多,起码十几款了。大家也不可能一一研读,下载,测试,使用它。但是又确实看到了大量数据挖掘文章都使用了这些免疫评分信息啊,比如:新鲜出炉(2021年6月)的文章:《Identification of a Ferroptosis- Related LncRNA Signature as a Novel Prognosis Model for Lung Adenocarcinoma》 ,就对比了 ESTIMATE, TIMER, MCP counter, CIBERSORTx,和ssGSEA ,如下所示:
生信技能树
2021/10/12
1.2K0
文献复现-单细胞揭示新辅助治疗后NSCLC的免疫微环境变化
文章在这:Tumor microenvironment remodeling after neoadjuvant immunotherapy in non-small cell lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing 方法:来自3名治疗前和12名接受新辅助PD-1阻断联合化疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的~92,000个单细胞的转录组。根据病理反应将12个治疗后样本分为两组:MPR(n = 4)和非MPR(n = 8)。
生信菜鸟团
2023/09/09
1.8K0
文献复现-单细胞揭示新辅助治疗后NSCLC的免疫微环境变化
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