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每月一生信流程之rnaseqDTU（差异转录本）

生信技能树

发布于 2019-11-09 09:19:45

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上一期我们推荐的是转录组经典表达量矩阵下游分析大全本期我们聊聊可变剪切，流程里面写的差异转录本，或者差异外显子，都差不多的意思。

全部bioconductor流程链接在；http://www.bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___GeneExpressionWorkflow 目前的27个流程，已经分门别类的整理好了，我们每个月学一个流程，预计两年就可以成为生物信息学领域的全栈工程师啦！

一图看懂DGE, DTE and DTU

参考文献：F1000Research 2019, 8:213 Last updated: 18 MAR 2019

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今天学习rnaseqDTU

我们首先看看转录组领域的基因表达相关流程吧，首先一起学习的是Swimming downstream: statistical analysis of differential transcript usage following Salmon quantification

http://www.bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/rnaseqDTU/inst/doc/rnaseqDTU.html

这个就没有中文版了，实际上是使用salmon软件把我们的RNA-seq测序的fastq数据根据参考转录组进行定量后，走几个R包流程。

在R里面安装这个bioconductor流程

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("rnaseqDTU")

因为原文写的实在是太详细了，我这里就不拷贝粘贴了，大家直接去阅读即可：

RNA-seq workflow for differential transcript usage following Salmon quantification
http://www.bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/rnaseqDTU/inst/doc/rnaseqDTU.R

全部目录如下；

3 Methods
3.1 Simulation
3.2 Operation
3.3 Quantification and data import
3.4 DTU testing
4 Workflow
4.1 Salmon quantification
4.2 Importing counts into R/Bioconductor
4.3 Transcript-to-gene mapping
5 Statistical analysis of differential transcript usage
5.1 DRIMSeq
5.2 stageR following DRIMSeq
5.3 Post-hoc filtering on the standard deviation in proportions
5.4 DEXSeq
5.5 stageR following DEXSeq
5.6 Citing methods in published research
6 DTU analysis complements DGE analysis
6.1 DGE analysis with DESeq2
6.2 DGE analysis with edgeR
6.3 End of workflow section

流程代码

首先是salmon的：

salmon quant -i $index -l A -1 $fq1 -2 $fq2  -p 4 -o quants/${sample}_quant

每个样本的fq测序数据都会被

image-20191106090849429

然后把所有的样本的quant.sf文件批量读取到R里面：

rm(list = ls())  
options(stringsAsFactors = F)
library(rnaseqDTU)
library(tximport)
files=list.files('quants/',pattern = 'quant.sf',recursive = T,full.names = T)
txi <- tximport(files, type="salmon", txOut=TRUE,
                countsFromAbundance="scaledTPM")
cts <- txi$counts
cts <- cts[rowSums(cts) > 0,]

library(GenomicFeatures)
# 文件 gencode.v32.annotation.gtf.gz 自己在gencode数据库网页下载即可
gtf <- "../database/gencode/gencode.v32.annotation.gtf.gz"
txdb.filename <- "gencode.v32.annotation.sqlite"
txdb <- makeTxDbFromGFF(gtf)
saveDb(txdb, txdb.filename)

txdb <- loadDb(txdb.filename)
txdf <- select(txdb, keys(txdb, "GENEID"), "TXNAME", "GENEID")
tab <- table(txdf$GENEID)
txdf$ntx <- tab[match(txdf$GENEID, names(tab))]

cts[1:3,1:3]
range(colSums(cts)/1e6)
head(txdf) 
cts=cts[rownames(cts) %in%  txdf$TXNAME,] 
dim(cts)
txdf <- txdf[match(rownames(cts),txdf$TXNAME),]
all(rownames(cts) == txdf$TXNAME)

counts <- data.frame(gene_id=txdf$GENEID,
                     feature_id=txdf$TXNAME,
                     cts)
save(counts,files,file = 'salmon-out.Rdata')

上面整理salmon结果的代码，看起来很复杂，其实修改的地方不多，值得注意的是：

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表达矩阵的第一列是基因的ID,第二列是转录本的ID，后面才是表达量哦。

有一个分组信息，我这里并没有给出我的代码，因为每个人的项目不一样，你需要自己制作，但凡有点R语言基础的，都是没有问题啦。就是 samps 那个变量的内容，有了它，下面的DRIMSeq流程分析差异转录本表达量才有意义。

接着运行DRIMSeq流程即可：

library(DRIMSeq)
d <- dmDSdata(counts=counts, samples=samps)
d
counts(d[1,])[,1:4]
n <- 12
n.small <- 6
d <- dmFilter(d,
              min_samps_feature_expr=n.small, min_feature_expr=10,
              min_samps_feature_prop=n.small, min_feature_prop=0.1,
              min_samps_gene_expr=n, min_gene_expr=10)
d
table(table(counts(d)$gene_id))
design_full <- model.matrix(~condition, data=DRIMSeq::samples(d))
colnames(design_full)
table(samps$condition)
set.seed(1)
system.time({
  d <- dmPrecision(d, design=design_full)
  d <- dmFit(d, design=design_full)
  d <- dmTest(d, coef="conditionControl")
})
res <- DRIMSeq::results(d)
head(res)
res.txp <- DRIMSeq::results(d, level="feature")
head(res.txp)
no.na <- function(x) ifelse(is.na(x), 1, x)
res$pvalue <- no.na(res$pvalue)
res.txp$pvalue <- no.na(res.txp$pvalue)
save(d,res,res.txp,file = 'DRIMSeq-out.Rdata')

是不是非常简单，就拿到了全部的转录本水平的差异表达呢，还可以可视化如下：

image-20191106091900001

可以看到，我举例的这个项目里面，tumor和control组的样本量是不平衡的，而且基因ID也不容易理解，大家可以自行转换为基因的symbol，这样出图更直观。

学习这样的流程是需要一定背景知识的

首先是LINUX学习

我在《生信分析人员如何系统入门Linux(2019更新版)》把Linux的学习过程分成6个阶段 ，提到过每个阶段都需要至少一天以上的学习：

第1阶段：把linux系统玩得跟Windows或者MacOS那样的桌面操作系统一样顺畅，主要目的就是去可视化，熟悉黑白命令行界面，可以仅仅以键盘交互模式完成常规文件夹及文件管理工作。
第2阶段：做到文本文件的表格化处理，类似于以键盘交互模式完成Excel表格的排序、计数、筛选、去冗余，查找，切割，替换，合并，补齐，熟练掌握awk,sed,grep这文本处理的三驾马车。
第3阶段：元字符，通配符及shell中的各种扩展，从此linux操作不在神秘！
第4阶段：高级目录管理：软硬链接，绝对路径和相对路径，环境变量
第5阶段：任务提交及批处理，脚本编写解放你的双手
第6阶段：软件安装及conda管理，让linux系统实用性放飞自我