每月一生信流程之rnaseqDTU（差异转录本）

上一期我们推荐的是转录组经典表达量矩阵下游分析大全 本期我们聊聊可变剪切，流程里面写的差异转录本，或者差异外显子，都差不多的意思。

全部bioconductor流程链接在；http://www.bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___GeneExpressionWorkflow 目前的27个流程，已经分门别类的整理好了，我们每个月学一个流程，预计两年就可以成为生物信息学领域的全栈工程师啦！

一图看懂DGE, DTE and DTU

参考文献：F1000Research 2019, 8:213 Last updated: 18 MAR 2019

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今天学习rnaseqDTU

我们首先看看转录组领域的基因表达相关流程吧，首先一起学习的是Swimming downstream: statistical analysis of differential transcript usage following Salmon quantification

• http://www.bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/rnaseqDTU/inst/doc/rnaseqDTU.html

这个就没有中文版了，实际上是使用salmon软件把我们的RNA-seq测序的fastq数据根据参考转录组进行定量后，走几个R包流程。

在R里面安装这个bioconductor流程

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("rnaseqDTU")

因为原文写的实在是太详细了，我这里就不拷贝粘贴了，大家直接去阅读即可：

• RNA-seq workflow for differential transcript usage following Salmon quantification
• http://www.bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/rnaseqDTU/inst/doc/rnaseqDTU.R

全部目录如下；

• 3 Methods
• 3.1 Simulation
• 3.2 Operation
• 3.3 Quantification and data import
• 3.4 DTU testing
• 4 Workflow
• 4.1 Salmon quantification
• 4.2 Importing counts into R/Bioconductor
• 4.3 Transcript-to-gene mapping
• 5 Statistical analysis of differential transcript usage
• 5.1 DRIMSeq
• 5.2 stageR following DRIMSeq
• 5.3 Post-hoc filtering on the standard deviation in proportions
• 5.4 DEXSeq
• 5.5 stageR following DEXSeq
• 5.6 Citing methods in published research
• 6 DTU analysis complements DGE analysis
• 6.1 DGE analysis with DESeq2
• 6.2 DGE analysis with edgeR
• 6.3 End of workflow section

流程代码

首先是salmon的：

salmon quant -i $index -l A -1 $fq1 -2 $fq2  -p 4 -o quants/${sample}_quant

每个样本的fq测序数据都会被

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然后把所有的样本的quant.sf文件批量读取到R里面：

rm(list = ls())  
options(stringsAsFactors = F)
library(rnaseqDTU)
library(tximport)
files=list.files('quants/',pattern = 'quant.sf',recursive = T,full.names = T)
txi <- tximport(files, type="salmon", txOut=TRUE,
                countsFromAbundance="scaledTPM")
cts <- txi$counts
cts <- cts[rowSums(cts) > 0,]

library(GenomicFeatures)
# 文件 gencode.v32.annotation.gtf.gz 自己在gencode数据库网页下载即可
gtf <- "../database/gencode/gencode.v32.annotation.gtf.gz"
txdb.filename <- "gencode.v32.annotation.sqlite"
txdb <- makeTxDbFromGFF(gtf)
saveDb(txdb, txdb.filename)

txdb <- loadDb(txdb.filename)
txdf <- select(txdb, keys(txdb, "GENEID"), "TXNAME", "GENEID")
tab <- table(txdf$GENEID)
txdf$ntx <- tab[match(txdf$GENEID, names(tab))]

cts[1:3,1:3]
range(colSums(cts)/1e6)
head(txdf) 
cts=cts[rownames(cts) %in%  txdf$TXNAME,] 
dim(cts)
txdf <- txdf[match(rownames(cts),txdf$TXNAME),]
all(rownames(cts) == txdf$TXNAME)

counts <- data.frame(gene_id=txdf$GENEID,
                     feature_id=txdf$TXNAME,
                     cts)
save(counts,files,file = 'salmon-out.Rdata')

上面整理salmon结果的代码，看起来很复杂，其实修改的地方不多，值得注意的是：

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表达矩阵的第一列是基因的ID,第二列是转录本的ID，后面才是表达量哦。

有一个分组信息，我这里并没有给出我的代码，因为每个人的项目不一样，你需要自己制作，但凡有点R语言基础的，都是没有问题啦。就是 samps 那个变量的内容，有了它，下面的DRIMSeq流程分析差异转录本表达量才有意义。

接着运行DRIMSeq流程即可：

library(DRIMSeq)
d <- dmDSdata(counts=counts, samples=samps)
d
counts(d[1,])[,1:4]
n <- 12
n.small <- 6
d <- dmFilter(d,
              min_samps_feature_expr=n.small, min_feature_expr=10,
              min_samps_feature_prop=n.small, min_feature_prop=0.1,
              min_samps_gene_expr=n, min_gene_expr=10)
d
table(table(counts(d)$gene_id))
design_full <- model.matrix(~condition, data=DRIMSeq::samples(d))
colnames(design_full)
table(samps$condition)
set.seed(1)
system.time({
  d <- dmPrecision(d, design=design_full)
  d <- dmFit(d, design=design_full)
  d <- dmTest(d, coef="conditionControl")
})
res <- DRIMSeq::results(d)
head(res)
res.txp <- DRIMSeq::results(d, level="feature")
head(res.txp)
no.na <- function(x) ifelse(is.na(x), 1, x)
res$pvalue <- no.na(res$pvalue)
res.txp$pvalue <- no.na(res.txp$pvalue)
save(d,res,res.txp,file = 'DRIMSeq-out.Rdata')

是不是非常简单，就拿到了全部的转录本水平的差异表达 呢，还可以可视化如下：

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可以看到，我举例的这个项目里面，tumor和control组的样本量是不平衡的，而且基因ID也不容易理解，大家可以自行转换为基因的symbol，这样出图更直观。

学习这样的流程是需要一定背景知识的

首先是LINUX学习

我在《生信分析人员如何系统入门Linux(2019更新版)》把Linux的学习过程分成6个阶段 ，提到过每个阶段都需要至少一天以上的学习：

• 第1阶段：把linux系统玩得跟Windows或者MacOS那样的桌面操作系统一样顺畅，主要目的就是去可视化，熟悉黑白命令行界面，可以仅仅以键盘交互模式完成常规文件夹及文件管理工作。
• 第2阶段：做到文本文件的表格化处理，类似于以键盘交互模式完成Excel表格的排序、计数、筛选、去冗余，查找，切割，替换，合并，补齐，熟练掌握awk,sed,grep这文本处理的三驾马车。
• 第3阶段：元字符，通配符及shell中的各种扩展，从此linux操作不在神秘！
• 第4阶段：高级目录管理：软硬链接，绝对路径和相对路径，环境变量
• 第5阶段：任务提交及批处理，脚本编写解放你的双手
• 第6阶段：软件安装及conda管理，让linux系统实用性放飞自我

然后是R学习

我在在生信分析人员如何系统入门R(2019更新版) 里面给初学者的知识点路线图如下：

• 了解常量和变量概念
• 加减乘除等运算（计算器）
• 多种数据类型（数值，字符，逻辑，因子）
• 多种数据结构（向量，矩阵，数组，数据框，列表）
• 文件读取和写出
• 简单统计可视化
• 无限量函数学习