全球首篇FFPE空间转录组分析揭示了肾细胞癌中三级淋巴结构抗肿瘤机制

自2020年10x genomics率先推出冰冻切片的空间转录组，不久之后10x 就发布了空间转录组在FFPE组织切片的protocol和分析软件，冰冻切片的运用早已取得了极大的进展，但是FFPE由于其仅有空间切片，缺少匹配的单细胞数据而限制了其广泛的运用，时至今日，全球首先运用FFPE空间转录组的文章Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer于3月份发表在了杂志 Immunity，文章仅用空间转录组就阐述了癌症研究的重要生物学问题，里面的研究内容和方法，非常值得我们借鉴。

先来了解一个小知识，三级淋巴结构

癌症三级淋巴组织（TLS）中免疫浸润的组成也称为三级淋巴器官或异位淋巴结构，是出生后在非淋巴组织中出现的免疫细胞的有组织聚集体。TLSs在生理条件下不存在，但在慢性炎症环境中形成。TLS可能在癌症类型之间有所不同。TLS的特点是CD20+ B细胞的内部区域被CD3+T细胞包围，尽管TLS的具体组成可能有所不同，但在T细胞区室中，CD4+T滤泡辅助（TFH）细胞通常代表主要亚群，但CD8+细胞毒性T细胞、CD4+ T辅助1（TH1）细胞和调节性T细胞（Tregs）也可以存在。类似于次级淋巴器官，三级淋巴组织包含T细胞区和B细胞区

• T细胞区：由T细胞，DC细胞和成纤维网状细胞组成
• B细胞区：包含生发中心，浆细胞，抗体和肿瘤抗原形成的免疫复合物，滤泡DC。 三级淋巴组织产生效应T细胞和B细胞，可以在肿瘤局部直接杀死肿瘤细胞，或者通过ADCC和CDC效应杀伤肿瘤细胞。三级淋巴组织的中枢记忆T细胞和B细胞，同时还担负监测肿瘤转移的职责。靠近肿瘤的三级淋巴组织的淋巴细胞则是肿瘤前体细胞或者肿瘤细胞的微环境，在肿瘤复发中有一定作用。

研究背景

在自身免疫性疾病、慢性感染、移植排斥和癌症中遭受慢性炎症和抗原持久性的组织中发现了三级淋巴结构 (TLS)。肿瘤内 TLS 的存在和密度与许多癌症类型的良好预后相关.

TLS 是在成纤维细胞网络上形成的有组织的淋巴样聚集体，包括一个 T 细胞区，其中成熟的树突细胞与 T 细胞接触，以及一个滤泡性 B 细胞区。成熟 TLS 的定义是存在包含 T 滤泡辅助 (Tfh) 细胞和与 B 细胞紧密接触的滤泡树突状细胞的生发中心 (GC)。最近的证据支持这样的结论，即含有 GC 的成熟 TLS，而不是没有 GC 的早期 TLS，与肝细胞癌、肺鳞状细胞癌、结直肠癌和胰腺癌的临床益处相关。GC的主要功能是产生记忆B细胞和分泌高亲和力抗体的 long-lived 浆细胞(PC)。B 细胞和 PC 转录组特征的高表达水平和高 PC 密度与几种癌症类型的较长存活率相关。在软组织肉瘤、黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌和其他肿瘤中，B 细胞和成熟 TLS 的存在比 T 细胞更准确地预测了对免疫检查点抑制剂 (ICI) 的治疗反应和存活率癌症类型。B 细胞和 PC 影响临床结果和对 ICI 反应的机制尚不清楚。尽管一些研究显示肿瘤内 B 细胞可以在某些癌症中产生针对肿瘤相关抗原的 IgG 和 IgA 抗体，但没有证据表明它们起源于肿瘤内发生的 B 细胞分化，特别是在 TLS 部位。

在目前的工作中，解决了 TLS 作为 B 细胞原位成熟驱动因素、产生抗体的 PC 的作用以及它们对 ICI 反应的影响的问题。研究了肿瘤的空间分辨转录组结构透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 原发性肿瘤的微环境 (TME)。通过关注 TLS 及其附近，展示了 B 细胞在不同成熟阶段的存在，支持 B 细胞反应的产生。分析证明了 B 细胞的体细胞超突变、克隆选择和扩增，以及 PC 产生的免疫球蛋白，表明肿瘤内部产生了完整的 B 细胞反应。此外，发现 IgG 和 IgA 阳性 PC 沿着 CXCL12 阳性成纤维细胞轨道在肿瘤内迁移。显示抗体（主要是 IgG）与肿瘤细胞结合，并且它们的存在与半胱天冬酶依赖性肿瘤细胞凋亡有关。在 IgG 染色的肿瘤细胞附近检测到呈现 caspase 3 活化的巨噬细胞表明它们可能是通过诱导 IgG 介导的肿瘤细胞死亡的效应物。最后，具有大量 IgG 阳性肿瘤细胞的患者对 ICI 反应表现出高反应率和更长的 PFS。

结果一、空间转录组揭示了TLS+ 肿瘤中富含 B 细胞的热点区域

使用冷冻（n = 12）和 FFPE 切片（n = 12）对 24 个 ccRCC 原发性肿瘤进行空间转录组学。在对切片进行 H&E 染色后，经验丰富的病理学家 (VV) 对每个肿瘤的整体组织以及 TLS 的存在和定位进行了注释。下图显示了一个 TLS+ 冷冻切片肿瘤、一个 TLS+ FFPE 肿瘤和一个 TLS- 冷冻切片肿瘤。碳酸酐酶9（蛋白质名称：CAIX，基因名称：Ca9）是ccRCC肿瘤细胞的标志物，在大多数ccRCC肿瘤中的表达与23/24肿瘤中的表达一致，并且在肿瘤切片中分布均匀。使用微环境populations (MCP)-counter评估 TME 的免疫和基质细胞群的分布，该counter从转录组谱估计细胞类型丰度。在下图所示的 TLS+ 肿瘤中，B 细胞谱系（包含识别从幼稚细胞到 PC 的所有成熟步骤的基因）和 T 细胞（识别不同的 T 细胞群）基因特征优先在位于TLS 区域中表达 。这些肿瘤表现出 CD8 T 细胞特征的低表达，在 TLS 区域略有富集（p = 0.017）。TLS 中的单核细胞谱系特征略高（分别为 p = 0.00081 和 p = 0.035），而 NK 细胞更广泛地分布在整个肿瘤切片中。内皮细胞和中性粒细胞均匀分布，在 TLS 内得分较低），而在 TLS 区域发现成纤维细胞特征的高表达。TLS 肿瘤没有显示出这种有组织的模式，MCP counter 分析显示 B 谱系评分非常低且分散分布，以及其他免疫和基质特征的分散定位。这些不同的 TME 空间组织模式在 8 个 TLS+ 和 4 个 TLS- 冷冻切片肿瘤以及 10 个 TLS+ 和 2 个 TLS- FFPE 肿瘤中始终可以识别，这表明 TLS 与 B 谱系、T 细胞和成纤维细胞特征的表达有关.

图1 Spatial transcriptomics of immune and stromal cell populations in the tumor microenvironment

结果二、免疫球蛋白(Ig) 基因的空间表达模式

通过对肿瘤区域和TLS区域的差异分析显示，主要的免疫细胞的表达基因和成纤维细胞的经典表达基因（immunoglobulin genes、B cell markers、T cell markers、fibroblasts markers）组成了TLS区域的主要表达特征，Ig 和 B 细胞相关基因在 TLS 印记特征中的显著富集促使研究关注 B 细胞。首先旨在精确定位与 TLS 相关的转录不同的 B 细胞亚型。使用稳健的细胞类型分解对扁桃体 B 细胞单细胞分析中定义的 B 细胞亚群进行空间映射，发现幼稚 B 细胞相关基因的表达稀少，尽管与 TLS 显著相关，并且与 FCRL4+ 记忆 B 细胞密切相关、GC B 细胞 (p = 0.0087) 和具有 TLS 的浆细胞特征。PC 相关基因 MZB1 的表达在 TLS 中高，而在冷冻切片肿瘤的肿瘤区域中总体低。在 FFPE 肿瘤中发现了类似的结果。然而，在肿瘤内的不同位置检测到许多分散的、远离 TLS 的 MZB1 表达点。MZB1 是浆母细胞特征的一部分，在 PC 中高度表达。由于浆母细胞仅限于 TLS 区域，并且在 TLS 外发现 MZB1 的高表达，因此表达 MZB1 的 PC 可能不仅存在于 TLS 中，而且存在于肿瘤bed中。由于 PC 的主要功能是产生抗体，于是分析了免疫球蛋白基因的空间表达。IGHM 几乎只在 TLS 区域表达，增强了 TLS 内非转换 B 细胞的存在，而 IGHG1、IGHA1 和 pan Ig（IGKC 和 JCHAIN 的几何平均值）基因在 TLS 区域高度表达，but also at distance in the tumors。IGHG1 和 IGHA1 的分散表达表明同种型转换的 PC 已在 TLS 中形成并在远处迁移。 为了进一步评估这些不同特征之间的空间协同定位，每个特征的表达被二分法，使用中值作为截止点，为每个spot定义“高”或“低”表达类别。当一个基因被两个特征共享时，它会从其中一个特征中删除，以避免其对统计分析的影响。因此，当分析 TLS 和 CXCL12 基因表达之间的重叠时，从 TLS imprint signature 中删除了 MZB1 以分析 TLS/MZB1 重叠和 CXCL12。然后通过计算两个特征之间的卡方检验来评估有意义的重叠，并用黄色突出显示分类为“高/高”的点。该分析不仅证实了 TLS 特征与 MZB1、成纤维细胞和 CXCL12 的共定位，而且还证实了成纤维细胞与 CXCL12、MZB1 与成纤维细胞以及 MZB1 与 CXCL12 在距 TLS 一定距离处的共定位。这些共定位在其他 TLS+ 肿瘤中得到证实，而在 TLS-肿瘤中观察到轻微或无关联。总体而言，得出结论，在 TLS+ 肿瘤中，表达 IGHG1 和 IGHA1 的 PC 存在于 TLS 附近，并且可能与成纤维细胞相关地在肿瘤内迁移。

图2 Spatial co-localization of TLS withgene signatures of B cell subtypes, plasma cells, immunoglobulins, and fibroblasts

结果三、BCR的空间图谱分析识别hypermutation和clonal selection

TLS 中 B 细胞成熟亚型和 PC 的共定位暗示了原位 B 细胞适应性免疫的产生。在此过程中，B 细胞会突变其 B 细胞受体 (BCR) 序列，并选择和扩增最亲和的克隆。为了证明这些事件，有必要研究 BCR 的核苷酸序列。Visium 空间技术基于条形码转录本的 RNA 测序，这能够访问原始转录本并执行空间 BCR repertoire 分析。使用了公开可用的实施 MiXCR，这是一种旨在从 50 个 RNA 测序数据中识别 BCR IgL 和 IgH 克隆型及其种系体细胞超突变的工具，以及 30 Frozen Visium 试剂盒，它使我们能够获得足够长度的 mRNA 转录物捕获大多数 IGL 和一些 IGH 序列的完整互补决定区 (CDR)3 区域。在 TLS+ 肿瘤中发现了最多的独特克隆型和总 Ig 计数。在 TLS 区域也发现了数量最多的独特轻链克隆型。通过测量 Ig 轻链序列的 V 区的突变计数与映射的 V 种系基因进行比较来评估 B 细胞成熟。中位 V 基因突变计数在 TLS 区域中显示低至中位水平，并且引人注目的是，在肿瘤区域中远离 TLS 的大部分是高度突变的序列。尽管如此，在 TLS 区域测量了全区域的突变，包括高度突变的序列，而距 TLS 一定距离的大多数 Ig 转录物富含高度突变的序列，表明体细胞超突变发生在 TLS 中，并表明突变的 PC 在整个肿瘤中迁移.

最后，为了确定扩增的 IgH 克隆型的克隆关系和位置，对 30 个 RNA-seq 空间数据进行了克隆性评估。克隆性由相同的 VH 基因家族、相同的 JH 基因和相同的 CDR3 长度以及 VH 序列之间的 CDR3 核苷酸序列的最大差异为 15% 来定义。为了可视化这些关系，计算了每个 VH CDR3 序列之间的 Levenshtein 距离，并用 TLS+ 肿瘤的圆形树表示它。总共确定了 31 个具有 2 至 16 个独特成员的克隆家族。在一个家族中，一些克隆可以在多达 20 个不同的空间位置被检测到多达 80 次。IgH 克隆型在 Visiumslide 上的定位证明了同一家族的克隆型聚集在 TLS 附近并在远处稀疏迁移。一些克隆型甚至可以在距它们所在的 TLS 区域高达 3 mm 处检测到可能已经生成。为了证实这些结果，在从配对的bulk 50 RNA-seq 推断的克隆型中寻找从空间 30 RNA 转录组学鉴定的克隆型的 CDR3 核苷酸序列。克隆家族 1 的 CDR3 序列 CATYNAGEGGRGYW 的克隆型也在bulk 50 个 RNA-seq 数据中发现，从而证实了分析的结果。此外，这些克隆型位于 TLS 内部和远离 TLS 的位置，表明相应 B 细胞克隆的迁移。

图3 Spatial BCR profiling identifies somatic hypermutation and clonal amplification occurring in TLS areas and propagation of selected clones in the tumor zone

结果4、浆细胞从 TLS 沿成纤维细胞分布迁移

为了分析肿瘤内 PCs 和成纤维细胞的位置以及原位 CXCL12 的表达，使用多发性骨髓瘤癌基因 1 (MUM1) (IRF4) 作为 PCs 和 COL1 (Col1a) 的特异性标志物对 FFPE 肿瘤切片进行多重 IF 标记) 用于成纤维细胞。在 TLS 区域内检测到双阳性 MUM1+ IgG+ PC 和一些 MUM1+ IgA+ PC，由连续载玻片上的显色 CD3/CD20 标记定义。在这些区域观察到 COL1+/CXCL12+ 成纤维细胞与 MUM1+ PC 并列。此外，在远离 TLS 的地方证明了 PC 沿着成纤维细胞轨道排列，嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纤维细胞网络中，从而证明它们在肿瘤床中的迁移。为了定量评估 PC 和成纤维细胞之间的空间关系，对 DAPI/MUM1/IgG/IgA IF 染色样品上的成纤维细胞核进行了 AI 检测。如下图所示，成纤维细胞核的检测映射了 COL1+ 成纤维细胞轨迹。绝大多数 PC 与成纤维细胞核非常接近，两个肿瘤的平均距离分别为 17.5 和 19 mm，其距离分布下图所示。在 44 个肿瘤样本上测得的平均距离为 25.7 mm。总而言之，这些数据概括了 Ig 和成纤维细胞转录物的共表达，以及成纤维细胞转录物和 CXCL12 的共表达，并验证了 PC 在 TLS 内的位置以及空间转录组学确定的成纤维细胞网状细胞 (FRC) 空间上的位置。值得注意的是，在被 MUM1+ IgG+ 成纤维细胞轨道包围的肿瘤巢中检测到与肿瘤细胞结合的 IgG。

图 4. Co-localization of PCs with fibroblasts and IgG tumor staining in the TLS+ tumors

结果5、TLS and Ig-producing PCs 与结合到凋亡肿瘤细胞的 IgG 抗体和对免疫治疗的反应有关

为了进一步研究 TLS、肿瘤内 PC 和 Ig 染色之间的联系，首先分析了 TLS 成熟度。成熟 TLS 的特点是 GC 包含一个被 T 细胞区包围的 B 细胞区，其中存在 CD4+PD1+ T 细胞、CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh 细胞和产生 CXCL13 的细胞。GC 区的特点是在外围检测到 CD23+ 滤泡树突细胞 (FDC)、BCL6+ CD20+ B 细胞和 PNAd+ HEV 网络。研究了 103 个肿瘤中 TLS 的存在与 PC 密度之间的相关性。观察到 TLS 的存在与 MUM1+ IgG+ 细胞和 MUM1+ IgA 细胞的密度之间存在显著关联。进一步研究了 57 个 TLS+ 样本上 TLS 成熟度标记与 MUM1+IgG+ 和 MUM1+IgA+ PCs 密度的相关性。发现含有 CD23+ FDC 网络、BCL6+ 细胞和 PNAd+ HEV 的 TLS 与 MUM1+IgG+ PC 和 MUM1+IgA+ PC 密度之间存在很强的相关性。这个研究，解决了可能在诱导肿瘤细胞凋亡中起作用的机制问题，虽然巨噬细胞和 NK 细胞是抗体依赖性细胞毒性的主要effectors，但是在不同的肿瘤类型没有发现明显的相关性。然而，研究发现具有大量凋亡细胞和高百分比 IgG 染色肿瘤细胞的肿瘤比具有大量凋亡细胞但低百分比 IgG 染色肿瘤细胞的肿瘤更容易被 CD68+ 巨噬细胞浸润。

图5 Tumors with TLS present increased IgG+ CAIX+ tumor cell staining compared with tumors with immature or no TLS. Association with tumor cell death and response to ICI.

就目前而言，空间转录组的运用还处于初级的阶段，深度挖掘方面具有非常大的潜力，这篇文章借助空间转录组，研究了肾细胞癌的冰冻和FFPE切片的细胞类型空间表达模式，证实了浆细胞与成纤维细胞的共定位、TLS对B细胞成熟、克隆选择和迁移的关键作用，揭示了前人未发现的在癌组织中B细胞对治疗和预后的显著意义。当然，空间转录组的运用这还是冰山一角，相信不久的将来空间转录组一定会给我们带来更多新的、未知的分析内容和见解。