提供180Mb的细胞图谱代码，Nature发的一个时间序列空间多组学细胞参考图谱研究

Basic Information

• 英文标题： A prenatal skin atlas reveals immune regulation of human skin morphogenesis
• 中文标题：产前皮肤图谱揭示了免疫调节对人类皮肤形态发生的影响
• 发表日期：16 October 2024
• 文章类型：Article
• 所属期刊：Nature
• 文章作者：Nusayhah Hudaa Gopee | Muzlifah Haniffa
• 文章链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-08002-x

Abstract

Para_01

1. 人类胎儿皮肤中存在先天免疫细胞，包括巨噬细胞，但它们是否仅在免疫中起作用或在形态发生中还有其他功能尚不清楚。
2. 在这里，我们组装了一个全面的多组学参考图谱，涵盖了胎儿期（受精后7-17周）的人类皮肤，结合了单细胞和空间转录组学数据，以表征皮肤的微解剖组织生态位。
3. 该图谱显示，非免疫细胞与免疫细胞之间的相互作用支撑了毛囊的形成，涉及无疤痕伤口愈合，并对皮肤血管生成至关重要。
4. 我们系统地比较了从人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞衍生的带毛发的皮肤类器官模型（SkO）与胎儿和成人皮肤。
5. SkO模型在毛囊发育过程中紧密再现了体内皮肤的表皮和真皮细胞类型，以及与遗传性毛发和皮肤疾病发病机制相关的基因表达。
6. 然而，SkO模型缺乏免疫细胞，且内皮细胞的异质性和数量显著减少。
7. 我们的胎儿皮肤细胞图谱表明，巨噬细胞和巨噬细胞衍生的生长因子在驱动内皮发育中发挥作用。
8. 事实上，将由诱导多能干细胞衍生的自体巨噬细胞转移到SkO培养物中后，血管网络重塑得到了增强。
9. 因此，先天免疫细胞是皮肤形态发生中的关键参与者，超出了它们在免疫中的传统角色，这一功能是通过与非免疫细胞的相互作用实现的。

Main

Para_01

1. 人类皮肤器官发生始于胃化作用之后，由两个主要的胚层发展而来。
2. 表皮，皮肤最外层，黑色素细胞和神经细胞起源于外胚层。
3. 真皮位于基底膜之下，含有内皮细胞和壁细胞，来源于中胚层（面部和颅部皮肤除外，它们起源于外胚层衍生的神经嵴细胞）。
4. 皮肤附属器，包括毛囊（HF）和皮脂腺，按头尾方向形成。
5. 胎儿期的毛囊在受孕后11至14周开始形成，起始于表皮乳头状突起（表皮层增厚的局部位点）与真皮凝集体（真皮成纤维细胞的聚集）之间的相互作用，而皮脂腺则从大约16周后开始发育。
6. 然而，关于这些发育时期人类胎儿皮肤的确切细胞组成以及细胞是否在支持皮肤形态发生的功能性微解剖生态位中相互作用的信息却很少。

Para_02

1. 胎儿皮肤在一个无菌环境中与羊水接触。
2. 然而，如巨噬细胞等免疫细胞早在妊娠6周就开始定植于皮肤，并表达一系列促炎基因，尽管与抗原呈递（例如，主要组织相容性复合体II类（MHCII））相关的基因仅在11周后才上调。
3. 11周前促炎基因表达与MHCII基因表达的分离表明，在早期妊娠期间，抗原呈递可能不是人类巨噬细胞的关键功能。
4. 结合它们在组织稳态和小鼠模型中的愈合作用的证据，这引发了巨噬细胞是否参与人类早期皮肤形态发生的问题。

Para_03

1. 我们目前的研究提供了7-17孕周人类胎儿皮肤的综合多组学细胞图谱。
2. 我们使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学和多重RNA原位杂交对人类胎儿皮肤进行了分析，以解析调节皮肤和毛囊形态发生过程中妊娠期动态细胞和分子变化。
3. 我们利用成人健康皮肤和毛囊数据集来比较和评估促进无疤痕皮肤愈合和指导新毛囊形成的发育特异性特征。
4. 我们使用带有毛发的SkO模型验证了巨噬细胞在胎儿皮肤血管网络形成中的作用。

Single-cell atlas of human prenatal skin

Para_01

1. 为了描述人类胎儿皮肤发育过程中不同谱系和细胞状态的作用，我们获取了从孕周7到17周的皮肤单细胞悬液，涵盖了第一和第二孕期（图1a）。
2. 我们进行了荧光激活细胞排序（FACS），以分离活的单一免疫（CD45+）和非免疫（CD45–）群体，并在进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析前增强角质形成细胞和内皮细胞的捕获（扩展数据图1a和补充表1和2）。
3. 生成了单细胞αβT细胞受体（TCR）测序数据，以准确解析T细胞亚群。
4. 使用多重RNA原位杂交（RNAscope）、新生成的空间转录组学（Visium）数据以及已发表的来自胚胎肢体的Visium数据（仅分析皮肤区域）进行了空间验证（图1a和补充表2）。
5. 此外，我们将新的和已发表的成人皮肤单细胞数据集、以及由人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞衍生的带毛囊的SkO模型的数据集进行了整合，以进行比较分析（图1a和补充表2）。
6. 我们还比较了体内胎儿和类器官毛囊与成人毛囊的scRNA-seq数据。
7. 我们的数据可以通过基于WebAtlas的门户（https://developmental.cellatlas.io/fetal-skin）进行交互式探索。
8. 本研究的分析软件已存档于Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.8164271）

Fig. 1: A single-cell atlas of human prenatal skin.

• a, 实验概述展示了从解离的胎儿皮肤细胞（n = 18, 7-17 妊娠周）生成单细胞 RNA 测序数据的过程。成人 HF11、成人健康皮肤和毛发生长的 SkO1 数据集被整合用于比较。空间实验使用 RNAscope、免疫荧光和 Visium 分析进行。
• b, 胎儿皮肤数据集的均匀流形近似和投影（UMAP）可视化，广泛注释了细胞状态，如图例中的颜色和数字所示。
• c, Milo 蜜蜂群图显示了妊娠期间胎儿皮肤中邻域的差异丰度，用广泛的细胞标签标注。红色和蓝色邻域分别在较早或较晚的妊娠期显著富集。颜色强度表示显著性的程度。
• d, 显示空间微环境（MEs）的点图。细胞类型到微环境的系数按细胞类型总和归一化，细胞类型到微环境的分配用颜色表示。ME5 高亮显示（灰色），表明巨噬细胞和内皮细胞共定位。
• e, 整合的胎儿皮肤、成人皮肤和 SkO1 数据集的 UMAP 可视化，按广泛的细胞谱系着色。ASDC，Axl+Siglec6+树突状细胞；DC，树突状细胞；HSC，造血干细胞；LC，朗格汉斯细胞；LE，淋巴管内皮；LTi，淋巴组织诱导细胞；MEMP，巨核细胞-红细胞-肥大细胞前体；NK 细胞，自然杀伤细胞；pDC，浆细胞样树突状细胞。a 中的图像使用 BioRender（https://biorender.com）创建。

Para_02

1. 我们的产前皮肤单细胞 RNA 测序数据集包含 534,581 个细胞，其中 433,961 个细胞通过了质量控制。
2. 广泛的细胞标签（表皮、真皮基质、免疫和内皮）和细胞状态的详细注释是根据差异表达基因（DEGs）分配的。
3. 差异丰度分析测试揭示了不同细胞群体在整个妊娠期的变化情况。
4. 在来源于外胚层的细胞中，神经细胞和构成第一个皮肤渗透屏障的表皮细胞在早期妊娠中富集，而超基底表皮细胞和毛囊细胞主要在晚期妊娠中观察到。
5. 来源于中胚层的细胞，包括皮肤成纤维细胞和内皮细胞，以及免疫细胞，在整个妊娠期都存在。
6. 先天免疫细胞，如巨噬细胞和先天淋巴样细胞（ILCs），从早期妊娠开始就存在，而 B 细胞和 T 细胞则在大约 10 周妊娠时伴随胸腺、骨髓和脾脏的形成而出现。
7. 一些巨噬细胞、ILCs 和成纤维细胞的亚群在早期和晚期妊娠中表现出不同的基因表达谱，这表明功能成熟或双波产生在发育过程中发生。

Para_03

1. 为了在原位定位从单细胞 RNA 测序数据中识别的细胞，我们对面部和腹部皮肤（10 周胎龄）以及胚胎下肢皮肤（6-8 周胎龄）的空间转录组学数据进行了 Cell2location 分析（补充表 2）。
2. 我们使用非负矩阵分解（NMF）评估细胞类型共定位，以计算预测微环境，并结合相关性分析。
3. 共定位通过两种或多种细胞类型共享一个微环境的高比例（图 1d）和/或细胞对之间的正相关系数来指示（扩展数据图 1e,f）。
4. NMF 可以预测在常规组织病理学分析中不易发现的重要细胞共定位。
5. 我们的分析预测了包含表皮、真皮、血管和神经细胞的产前皮肤中的不同微环境，每个微环境中包括特定类型的免疫细胞（图 1d 和扩展数据图 1e,f）。
6. 巨噬细胞与内皮细胞和神经细胞在‘早期和晚期神经血管微环境’（ME1 和 ME5，分别为）中共定位，而前真皮浓缩物（pre-Dc）细胞基于相关性分析与树突状细胞和淋巴细胞共定位（图 1d 和扩展数据图 1e,f）。
7. 这些观察结果表明，免疫细胞可能占据定义明确的微解剖生态位，在那里它们在早期妊娠期间具有非免疫功能。

Para_04

1. 我们接下来将人类胎儿和成人皮肤数据与 SkO 模型进行了整合和比较。
2. 目的是确定 SkO 模型在分子水平上重现人类皮肤分化程度及其潜在功能，用于评估免疫细胞在皮肤形态发生中的作用（图 1e 和扩展数据图 2a、b）。
3. 总体而言，SkO、胎儿和成人皮肤之间的细胞状态是保守的，但 SkO 细胞状态与胎儿皮肤的匹配度高于成人皮肤，这一现象在整个培养过程中一直存在（扩展数据图 2c、d 和补充表 5）。
4. 然而，不同皮肤细胞谱系的分化速度各不相同。
5. 即使经过 19 周的培养，成纤维细胞、血管周细胞和施万细胞与成人皮肤细胞状态的对应概率仍然较低（扩展数据图 2d 和补充表 5）。
6. 相比之下，角质形成细胞和黑色素细胞表现出加速分化，在 SkO 培养 4 周时即可观察到与成人细胞状态的对齐（扩展数据图 2d 和补充表 5）。
7. 值得注意的是，SkO 模型重现了胎儿皮肤的不同组成部分，包括毛囊、表皮、神经细胞和真皮成纤维细胞，但未包含免疫细胞，且内皮细胞显著减少。

Epidermal placode and matrix formation

Para_01

1. 人类胚胎发育中新发毛囊形成的精确机制主要从小鼠研究中推断出来。
2. 人类研究主要集中在发育过程中的形态学描述或成人皮肤中循环的毛囊上。
3. 我们的单细胞数据集捕捉到了毛囊形成的开始，这使得我们能够直接比较产前发育中的毛囊和成人循环中的毛囊。

Para_02

1. 孕龄8周前的皮肤由一层表皮细胞覆盖真皮基质组成，从11孕周开始观察到外皮层脱落（图2a）。
2. 在14-15孕周，观察到基底细胞（毛囊胚和生殖细胞）的出芽和毛乳头（毛发胚）的延长（图2a）。
3. 在17孕周，毛发胚在分层的表皮层下明显可见（图2a）。

Fig. 2: Human prenatal HF development.

• a, 胎儿皮肤和毛囊形态发生（用苏木精和伊红染色）的代表性图像。比例尺，200 µm。
• b, 胎儿皮肤表皮细胞状态的平均比例。
• c, 大面积（顶部）和放大后的毛囊周围（底部左）和毛囊间（底部右）RNAscope 图像显示了胎儿皮肤（15 孕周）中的 ORS（SLC26A7）、基质（SHH）和 Dp（NDP），以及围绕毛囊的 Treg 细胞（FOXP3）。比例尺，100 µm（顶部）或 20 µm（底部）。
• d,e, 推断出的胎儿皮肤和 SkO 表皮细胞（d）及成纤维细胞（e）的伪时间轨迹。UMAP 上覆盖了基于分区的图抽象（PAGA）（默认阈值），按细胞状态着色，显示连接性（虚线）和过渡（箭头）。
• f, WNT2+ 成纤维细胞和 HOXC5+ 早期成纤维细胞的空间分布。预测的细胞丰度显示为每个点的双色梯度之和（左；比例尺，100 µm）或所有位于相同距离处的点的平均值（右；均值（线）± 2 倍标准误差（阴影区域））。虚线表示组织边界。
• g, CellPhoneDB 预测的间充质-上皮相互作用（早期，未成熟基底；晚期，DPYSL2+ 基底，POSTN+ 基底，原基，基质，ORS，CL，IRS 和角质层/皮层）。显示了每对胎儿皮肤细胞的前十个相互作用（顶部），并在 SkO 中绘制了相同的相互作用（底部）。颜色标度代表配体-受体对的平均表达值。CellPhoneDB 计算的显著性使用了经验洗牌，并调整了假发现率（FDR）。
• h, RNAscope 图像显示早期上皮（SERPINB7+）和预 Dc 细胞（PDGFD+）中的 ACKR3 和 CXCL12 表达（顶部）以及在真皮-表皮交界处的共表达（箭头，右下）。比例尺，20 µm。
• i, 考虑到 15 个等间距的伪时间点，SkO 和胎儿皮肤伪时间轨迹的对齐。左侧，热图显示了每个类器官-胎儿伪时间点对的匹配转录因子数量（颜色标度）和沿伪时间的所有转录因子的平均对齐路径（白线）（对角路径表示最佳匹配的伪时间点对，垂直和水平路径表示不匹配）。右侧，按细胞类型组成可视化每个伪时间点的平均对齐映射。有关统计和可重复性的详细信息，请参阅方法。源数据

Para_03

1. 与我们的组织学观察一致，我们从14孕周（PCW）的单细胞RNA测序数据中鉴定出了毛囊（HF）细胞，这些细胞包括基板、毛乳头（SHH+）、外根鞘（ORS）（SLC26A7+）、伴层（CL）、内根鞘（IRS）和毛小皮及皮质细胞（毛小皮/皮质；毛囊内层的一部分）（图2a-c，扩展数据图3a,b和补充表6）。
2. 此外，我们还观察到了未成熟和成熟的毛囊间表皮（IFE）细胞。
3. 未成熟的IFE细胞，包括角质形成细胞、未成熟的基底细胞和未成熟的上基底细胞，从7孕周开始出现，并在11孕周后减少，这一时期是从胚胎皮肤向胎儿皮肤转变的阶段（图2b）。
4. 成熟的基底细胞（DPYSL2+）和上基底IFE细胞在11孕周后增加，而POSTN+基底细胞在整个妊娠期都存在（图2b和扩展数据图3b）。
5. 皮脂腺和顶泌腺细胞在16孕周后成熟，在这些阶段没有被捕获。
6. 相应地，皮脂细胞前体从SkO分化第133天开始出现。
7. 在真皮层中，我们从12孕周开始观察到毛囊特化的成纤维细胞、真皮凝聚物（Dc）和真皮乳头（Dp）（扩展数据图3c）。

Para_04

1. 我们评估了毛囊基质细胞，这些细胞来源于表皮原基，这是一种仅存在于胎儿期而不在成年毛囊中存在的特殊细胞状态（扩展数据图3d，e）。
2. 与成年毛囊相比，胎儿皮肤基质细胞中与趋化性相关的基因表达增加，例如CXCL14，这是一种先前报道可以招募调节性T（Treg）细胞的趋化因子，以及控制自身免疫的基因（CD24）。
3. 这一结果突显了Treg细胞积累和免疫保护在基质分化早期阶段的潜在作用（扩展数据图3f）。
4. 已知Treg细胞在妊娠晚期第二孕期（约21周）和出生后皮肤中定位于毛囊周围。
5. RNAscope（FOXP3+）和免疫荧光染色（FOXP3+）显示，早在15周妊娠期，Treg细胞就主要位于毛囊内及其周围，而不是毛囊间皮肤（图2c和扩展数据图3g，h）。

Para_05

1. 整合的产前皮肤和 SkO 数据中推断出的表皮细胞轨迹和伪时间分析预测 POSTN+ 基底细胞将分化为两条路径：ORS/CL 轨迹，包括 DPYSL2+ 基底细胞、ORS 和 CL；以及 IRS 轨迹，涉及基板、基质、角质层/皮层和 IRS（图 2d，扩展数据图 4a 和补充表 7）。
2. 沿着 ORS/CL 轨迹，我们识别了由 DPYSL2+ 基底细胞上调的新基因，如 AGR2，以及先前报道的与 ORS 分化相关的基因（BARX2 和 SOX9）（扩展数据图 4b、c 和补充表 7）。
3. AGR2 在 IRS 轨迹上表达下调，而已知的基质标记物如 SHH 和 WNT10B 则上调（扩展数据图 4b、c 和补充表 7）。
4. AGR2 的丢失，其功能在于组装富含 HFs 的半胱氨酸受体，促进细胞迁移。
5. 我们的研究结果表明，POSTN+ 基底细胞中增加的细胞迁移可能参与了基板的特化和真皮内陷。

HF mesenchymal differentiation

Para_01

1. 我们确定了在毛囊发育过程中与表皮细胞进行交流的真皮细胞类型，并捕获了人类 Dc（真皮乳头）的前体细胞。
2. 在小鼠中，过渡性的 PDGFRA+FOXD1+SOX2 低表达成纤维细胞，称为前 Dc 细胞，聚集形成 Dc（FOXD1+SOX2+），后者紧邻上皮毛囊基板。
3. 利用同源标记基因，我们在人类胎儿皮肤中标注了前 Dc 细胞和 Dc。
4. 随着毛囊内陷，Dc 在其基部被包裹形成 Dp（NDP+，SOX2+）。

Para_02

1. 为了推断前体 Dc 细胞和 Dc 和 Dp 的起源，我们对整合的产前皮肤和 SkO 成纤维细胞簇进行了轨迹和伪时间分析（图 2e、扩展数据图 4d 和补充表 7）。
2. 我们排除了 FRZB+ 成纤维细胞，这些细胞主要出现在最早妊娠阶段（7 周）的一个样本中（扩展数据图 3c）。
3. 尽管在产前皮肤中很少见，FRZB 表达的成纤维细胞存在于几个其他发育中的器官中（扩展数据图 4e）。
4. 推断的轨迹分析预测，HOXC5+ 早期成纤维细胞（位于真皮上层（图 2f），并且在 11 周前很丰富（扩展数据图 3c））沿着两条路径分化：第一条（毛囊成纤维细胞轨迹）形成了毛囊特化的成纤维细胞（前体 Dc 细胞，Dc 和 Dp），第二条（真皮成纤维细胞轨迹）形成了 WNT2+ 成纤维细胞和 PEAR1+ 成纤维细胞（11 周后丰富）（图 2e、扩展数据图 3c 和 4d 以及补充表 7）。
5. 沿着毛囊成纤维细胞的伪时间，随着前体 Dc 细胞向表皮迁移，参与细胞粘附调节（ADAMST1）、细胞间接触（CLDN11）和定向迁移（CXCL12）的基因上调，这表明了一个集体迁移的过程（扩展数据图 4f 和补充表 7）。
6. 当前体 Dc 细胞聚集到 Dc 时，参与胶原纤维形成和细胞粘附（COL6A3、MFAP4 和 PTK7）的基因表达（扩展数据图 4f 和补充表 7）。
7. Dp 的形成特征是 RSPO3 和 WNT5A 基因（扩展数据图 4f 和补充表 7），这些基因协调相邻毛囊基质细胞的分化。

Para_03

1. 我们探讨了指导早期毛囊形成的间充质-上皮相互作用。
2. 受体-配体分析预测了由前Dc细胞表达的CXCL12（扩展数据图4g,h）与表皮基底细胞上的ACKR3之间的相互作用（图2g和补充表8）。
3. RNAscope分析证实这两个基因共定位（图2h）。
4. 这一结果表明，CXCL12可能与ACKR3相互作用，介导前Dc细胞的迁移。
5. 值得注意的是，淋巴组织诱导细胞和ILC3细胞也被预测与前Dc细胞通过参与调节细胞黏附和迁移的配体-受体信号（CXCL12-CXCR4和CXCL12-DPP4）共定位和相互作用（扩展数据图1f和5a及补充表8），这表明先天免疫细胞可能在早期毛囊发育过程中支持前Dc细胞的迁移。
6. 需要进一步的实验来功能验证这些相互作用在产前毛发生长中的作用。

Para_04

1. 伴随胎盘凹陷形成的 Dc 表达了 FAM3C 和 EFNB1，它们分别预测与胎盘上的 LAMP1 或 CXADR 和 EPHB6 相互作用，并且据报道促进细胞迁移和侵袭。
2. 最后，来自 Dp 的 RSPO3 预测与基质细胞中的 LGR4 和 LGR6 相互作用，以促进毛囊上皮细胞的增殖。
3. 值得注意的是，在毛囊形成相应阶段的 SkO 模型的间充质细胞和上皮细胞之间，这些突出的相互作用是保守的。
4. 这些结果为我们的发现提供了正交验证，并强化了 SkO 作为产前皮肤发育准确模型的实用性。

Para_05

1. 我们进一步使用 Genes2Genes 分析框架比较了毛囊成纤维细胞轨迹中转录因子（TFs）的表达，以评估产前皮肤和 SkO 模型之间的分化轨迹对齐情况。
2. 总体而言，我们在伪时间上观察到了大量匹配的转录因子，这表明产前皮肤和 SkO 在毛囊成纤维细胞分化过程中具有相似的激活基因调控程序（图 2i 和补充表 9）。
3. 在伪时间上不匹配或在早期和晚期伪时间驱动错位的转录因子（例如，HOXA7 和 BARX1）主要归因于产前皮肤（躯干和肢体）和 SkO（神经嵴分化）之间真皮细胞来源的不同（扩展数据图 5d,e 和补充表 9）。

Para_06

1. 我们还评估了先前报道的小鼠毛囊形成过程中基因的表达谱。
2. 相似的信号通路被上调，包括用于毛囊定位的 WNT 和 EDA，用于抑制表皮细胞中毛囊形成的骨形态发生蛋白（BMP）和 noggin，以及用于毛囊向下生长的 PDGFA 和 TGFβ 信号。
3. 此外，类似于小鼠皮肤中的成纤维细胞分化，人类胎儿皮肤中的前 Dcs、Dc 和 Dp 及真皮成纤维细胞也源自一个共同的成纤维细胞前体（HOXC5+ 早期成纤维细胞）。
4. 然而，人和小鼠毛囊的跨物种数据分析显示，人类前 Dc 细胞和 Dc 不仅与小鼠皮肤中的对应细胞对齐，而且还与较早分化阶段的成纤维细胞对齐。
5. 这一结果表明，对于相应的细胞类型，小鼠毛囊成纤维细胞比人类胎儿皮肤中的更为分化。
6. 此外，据报道，小鼠中真皮成纤维细胞分化为组织学定义的亚群（乳头状和网状）发生在早期（大约胚胎第 12.5 天）。
7. 我们的胎儿皮肤成纤维细胞未显著表达乳头状成纤维细胞标记物（例如，COL13A1），这表明乳头状和网状成纤维细胞之间的区别在 17 周后才出现。
8. 这些人类和小鼠皮肤之间的差异可能归因于妊娠期长度和分化速度的生物体差异。
9. 细胞分化在小鼠中发生得更快，而人类较长的妊娠期允许更先进的成熟在子宫内进行。

Genetic hair and skin disorders

Para_01

1. 在绘制了胎儿皮肤毛囊的分化图后，我们利用这些信息来评估遗传性毛发疾病在子宫内的根源程度。
2. 已知会导致毛发生长减少（少毛症）或毛发形状异常（例如，扭曲毛发）的基因（补充表12）在ORS/CL轨迹、IRS轨迹和毛囊成纤维细胞轨迹伪时间（扩展数据图4f和6a,b）以及胎儿毛囊细胞状态（扩展数据图6c）中表达。
3. 这一发现表明，这些疾病是由于毛囊发育功能障碍所致。

Para_02

1. 导致表皮松解性水疱病（EB）的基因在产前表皮细胞和表皮-真皮交界处高度表达，这种遗传性皮肤水疱病的特点是由于表皮和相邻的表皮-真皮交界处结构缺陷导致的皮肤脆弱。
2. 对于营养不良型 EB 的基因治疗研究已经确定了表达 COL7A1 的成纤维细胞是一种有前景的治疗策略。
3. 我们在产前皮肤和 SkOs 中观察到了多个成纤维细胞亚群中的 COL7A1 表达，这支持了基因治疗的方法。
4. 与先天性鱼鳞病相关的基因主要局限于角质形成细胞，这类疾病是由于表皮分化异常引起的一组疾病。

Para_03

1. 值得注意的是，我们在产前皮肤和 SkO 中观察到了类似的基因表达模式，这些模式与上述遗传性毛发和皮肤疾病相关（扩展数据图 6c,d,f），这支持了 SkO 作为研究先天性疾病模型的价值。
2. 尽管我们发现与这些疾病相关的基因表达局限于结构细胞，但疾病的表型通常与免疫细胞浸润有关，这表明在发病机制中存在皮肤-免疫相互作用。

Scarless healing and potential macrophage contribution

Para_01

1. 人类胎儿皮肤能够在没有疤痕的情况下愈合，但在孕周24周后失去这种能力。
2. 疤痕是由于真皮成纤维细胞产生的胶原蛋白聚集以及覆盖的表皮未能完全再生导致的。
3. 为了确定可能赋予早期胎儿皮肤无疤痕愈合特性的细胞和分子机制，我们研究了真皮成纤维细胞亚群组成和转录谱的时间变化（扩展数据图3c和7a）。
4. 我们首先将胎儿皮肤真皮成纤维细胞与健康成人皮肤成纤维细胞进行了比较。
5. 所有成人的成纤维细胞亚群都表达了高水平的炎症细胞因子和受体（例如，IL6和IL1RA）以及抗原呈递（例如，HLA-A）、固有免疫和炎症反应（例如，CD55和PTGES）和细胞衰老（CDKN1A）相关的基因（图3a和补充表13-15）。
6. 相比之下，胎儿皮肤成纤维细胞上调了参与免疫抑制（CD200）、炎症调节（例如，RAMP2）和组织再生（MDK）的基因（图3a和补充表13-15）。

Fig. 3: Early dermal fibroblasts and macrophages potentially contribute to scarless skin healing.

• 点图显示了按方差缩放的平均表达量（点的颜色）和表达细胞的百分比（点的大小），这些差异表达基因（DEGs）分别由产前（抗炎和免疫抑制）和成人皮肤成纤维细胞（促炎和免疫激活）表达。
• 矩阵图显示了Milo生成的DEGs（按功能分组）按孕周（按PCW分组）在WNT2+成纤维细胞中的按方差缩放的平均表达量（颜色）。加粗的标签表示在文中特别提到的基因。
• 条形图显示了选定细胞类型对（巨噬细胞和WNT2+成纤维细胞）之间的共定位，通过计算每个位置标准化细胞类型丰度之间的正皮尔逊相关系数来表示。皮尔逊相关系数是在Visium样本的所有覆盖皮肤的位置上计算的；每个样本用单独的条形表示。
• LYVE1+巨噬细胞和WNT2+成纤维细胞（上两行）以及TML巨噬细胞和WNT2+成纤维细胞（下两行）的空间分布（代表性8孕周样本）。预测的细胞丰度显示为每位置两种颜色梯度的总和（左；比例尺，100微米）或在与组织边界相同距离的所有位置上的平均值（右；均值（线）± 2标准误（阴影区域））。虚线表示组织边界。
• 免疫荧光（代表性10孕周产前皮肤冷冻切片）显示LYVE1+巨噬细胞（CD45+LYVE1+）与成纤维细胞（VIM+）共定位。比例尺，50微米。
• 点图显示了按方差缩放的平均表达量（点的颜色）和表达细胞的百分比（点的大小），这些基因（按功能分组）在产前和成人皮肤巨噬细胞中被TML巨噬细胞上调。加粗的标签表示在文中特别提到的基因。
• 条形图显示了选定细胞类型对（TML巨噬细胞和神经细胞）之间的共定位，通过计算每个位置标准化细胞类型丰度之间的正皮尔逊相关系数来表示。皮尔逊相关系数是在Visium样本的所有皮肤位置上计算的；每个样本用单独的条形表示。有关统计和可重复性的详细信息，请参见方法部分。

Para_02

1. 成纤维细胞的基因表达谱在WNT2+和PEAR1+产前成纤维细胞中增加，这些细胞在妊娠后期较为丰富（图3a及扩展数据图3c和7b）。
2. 与促炎性成纤维细胞表型相关的基因（如APOE、IGFBP7和ITM2A）也在HOXC5+成纤维细胞向PEAR1+成纤维细胞转变过程中上调（扩展数据图7c）。
3. 除了早期和晚期妊娠中富集的成纤维细胞亚群之间的转录组学差异外，我们还观察到在整个妊娠期间WNT2+成纤维细胞群体内的差异（扩展数据图1d）。
4. 晚期妊娠WNT2+成纤维细胞上调了与细胞外基质和胶原沉积相关的基因（例如COL1A1），而早期WNT2+成纤维细胞则有涉及细胞生长和分化的差异表达基因（例如SFRP1）（图3b，扩展数据图7d及补充表16-18）。
5. 值得注意的是，WNT2+和PEAR1+产前成纤维细胞表达了多个与细胞衰老（如CDKN1A）、细胞因子通路（例如IL1R1）和胶原沉积（例如POSTN）相关的基因（图3a,b），这些基因在纤维化皮肤疾病中的病理性成纤维细胞中高度表达。
6. 这些结果进一步支持了我们在妊娠后期逐渐获得促进疤痕形成的基因的发现，这与临床观察到的第三孕期皮肤瘢痕形成一致。

Para_03

1. 巨噬细胞在促进伤口愈合中的作用已在出生后的小鼠皮肤和成人的人类皮肤中被描述。
2. 在胎儿皮肤中，巨噬细胞亚群（扩展数据图 7e,f）预计在早期妊娠中与成纤维细胞、神经细胞和血管细胞在不同的组织微环境中共同定位（图 1d）。
3. 具体而言，LYVE1+ 巨噬细胞与 WNT2+ 成纤维细胞共同定位（图 3c-e），并通过血小板衍生生长因子（PDGFs）及其相应的受体（PDGFRα 和 PDGFRβ）与成纤维细胞上的表达进行预测的相互作用（扩展数据图 7g 和补充表 8）。
4. 巨噬细胞与成纤维细胞之间的相互作用维持了脾脏、腹膜和心脏等多种器官的组织稳态。
5. 我们鉴定出额外的生长因子相互作用（IGF1-IGF1R 和 GRN-EGFR）（扩展数据图 7g 和补充表 8），表明 LYVE1+ 巨噬细胞参与了胎儿皮肤真皮成纤维细胞的维持。

Para_04

1. 我们最近发现了卵黄囊来源的 TREM2+ 巨噬细胞，它们与来自其他发育器官（如大脑、产前皮肤和性腺）的类小胶质巨噬细胞共享表达谱（P2RY12、CX3CR1 和 OLFML3）。
2. 产前皮肤中的 TREM2+ 类小胶质（TML）巨噬细胞与胚胎脑小胶质细胞高度相关，并共表达了包括免疫抑制受体（例如 CX3CR1）和调节 IL-6 产生的基因（例如 SYT11）在内的免疫调节基因。
3. 炎症和 IL-6 的下调赋予了小鼠皮肤移植和胎儿伤口抗纤维化特性。
4. TML 巨噬细胞预计在早期产前皮肤（6-8 孕周）中与 WNT2+ 成纤维细胞共定位，而 WNT2+ 成纤维细胞的 IL6 表达相比成年成纤维细胞有所下调。
5. 这使我们推测巨噬细胞可能对产前皮肤的无疤痕愈合有潜在贡献。
6. 此外，由 TML 巨噬细胞和 LYVE1+ 巨噬细胞表达的 GAS6 预计与 WNT2+ 成纤维细胞上的 AXL 受体相互作用，这些相互作用可以诱导免疫抑制和组织修复。

Para_05

1. 我们进一步比较了产前皮肤成纤维细胞和巨噬细胞与驯鹿鹿角皮肤（愈合不留疤痕）和背部皮肤（愈合留疤）中的相应细胞。
2. 早孕期人类皮肤成纤维细胞与促进再生的驯鹿成纤维细胞对应的可能性更高，而在晚孕期，与促进纤维化的成纤维细胞匹配的可能性更高（扩展数据图8d和补充表19）。
3. 因此，几个促进再生的基因（例如CRABP1和MDK）在晚孕期产前皮肤中表达下调（扩展数据图8e和补充表20）。
4. 值得注意的是，产前皮肤巨噬细胞类似于在驯鹿鹿角皮肤中富集的‘早期巨噬细胞’，但不类似于背部皮肤中的巨噬细胞（扩展数据图8f和补充表21）。
5. 通过使用SkO来源的成纤维细胞进行划痕实验，这些细胞在有或没有iPS细胞衍生的巨噬细胞共培养的情况下，我们证明了当成纤维细胞与巨噬细胞共培养72小时后，划痕伤口宽度闭合得到改善（扩展数据图8g）。

Para_06

1. 总的来说，我们的发现表明，在早期妊娠期间，胎儿皮肤成纤维细胞下调了参与细胞外基质形成、胶原沉积和炎症的基因，这可能有利于组织再生而非瘢痕形成。
2. 根据我们的数据和先前的研究，我们还提出早期皮肤巨噬细胞在赋予早期胎儿皮肤无瘢痕愈合的独特性质方面可能发挥潜在作用。
3. 然而，需要进一步的研究来完全阐明人类胎儿皮肤中巨噬细胞与成纤维细胞之间的相互作用，并最终确定它们在无瘢痕愈合中的作用。

Macrophages in cutaneous neural differentiation

Para_01

1. TML 巨噬细胞也被预测与胎儿皮肤中的施万细胞共定位（"早期神经血管微环境"，ME1）（图 1d 和 3g），并表达了与细胞迁移和神经发育相关的基因（图 3f，扩展数据图 8c 和补充表 22 和 23），这反映了小鼠皮肤中脑小胶质细胞和周围神经相关巨噬细胞的功能。
2. TML 巨噬细胞被预测与施万细胞相互作用，有助于突触形成和轴突导向（VEGFA–NRP1，VEGFA–NRP2，SEMA3C–NRP2 和 SEMA3E–PLXND1）（扩展数据图 8h 和补充表 8）。
3. 这些发现表明，胎儿皮肤中的巨噬细胞可能支持皮肤周围神经系统在早期妊娠期间的建立，正如先前在小鼠皮肤中报道的那样。

Macrophages support prenatal skin angiogenesis

Para_01

1. 巨噬细胞在胎儿器官发育期间和产后环境（如癌症相关血管生成）中的血管生成中发挥作用。
2. 此外，在人类发育过程中，观察到表达促血管生成基因的巨噬细胞出现在多种组织中。
3. Visium 解卷积分析预测了胎儿皮肤巨噬细胞与内皮细胞（"早期和晚期神经血管微环境"，ME1 和 ME5）的共定位（图 1d 和扩展数据图 1e）。
4. 基因本体分析显示，四种巨噬细胞亚群（LYVE1+、MHCII+、TML 和铁循环）表达了促进血管生成的基因程序（补充表 23-26）。
5. 基因模块表达谱表明，LYVE1+ 和 TML 巨噬细胞促进了萌芽性血管生成（新血管的生长），LYVE1+ 巨噬细胞促进了血管形态发生，铁循环巨噬细胞促进了内皮细胞趋化（扩展数据图 8i 和补充表 27）。
6. 与此发现一致，多重 RNAscope 和免疫荧光染色显示 LYVE1+ 和 TML 巨噬细胞与内皮细胞紧密相邻（图 4a 和补充视频 1）。
7. 预测的配体-受体相互作用与巨噬细胞和内皮细胞之间的相互通讯支持血管生成、趋化性和细胞迁移一致（例如，CXCL8-ACKR1 和 CCL8-ACKR1）（扩展数据图 9a 和补充表 28）。

Fig. 4: Macrophages support prenatal skin angiogenesis.

• a, 在产前皮肤中显示内皮与巨噬细胞紧密靠近。左侧，使用RNAscope对冷冻切片进行成像，包括内皮（CDH5）、TML巨噬细胞（P2RY12）和巨噬细胞（CD68）。比例尺，100微米。中间，使用免疫荧光对冷冻切片进行成像，显示LYVE1+巨噬细胞（LYVE1+CD45+）和内皮细胞（CD31+）。比例尺，10微米。右侧，从全装免疫染色获得的内皮细胞（CD31+）和LYVE1+巨噬细胞（LYVE1+）共定位区域（品红色）的三维渲染。比例尺，80微米（顶部）或5微米（底部）。
• b, 产前皮肤和SkO中内皮细胞状态的UMAP可视化。
• c, 胎儿皮肤内皮细胞状态在整个妊娠期中的平均比例（条形颜色表示）。
• d, 推断出的胎儿皮肤内皮细胞状态沿动脉轨迹和静脉轨迹分化的伪时间轨迹：UMAP上叠加了PAGA（默认阈值），按细胞状态着色，显示连接性（虚线）和过渡（箭头）。
• e, 示意图展示了胎儿皮肤和SkOs在促血管生成和抗血管生成因子及其相应受体方面的差异。
• f, 第47天SkO的代表性全装免疫荧光图像，未与巨噬细胞共培养（顶部）和与巨噬细胞共培养（底部），显示巨噬细胞（CD45）、内皮（CD31）和DAPI核染色（蓝色）。比例尺，100微米。
• g, 量化第47天SkOs中内皮细胞覆盖度，分别在两个批次的SkOs和巨噬细胞分化后，与巨噬细胞共培养（n=5，品红色）和不与巨噬细胞共培养（n=5，灰色）。数据为均值±标准差，统计分析采用非配对t检验。
• h, 第47天SkO与巨噬细胞共培养（共培养第35天）的冷冻切片免疫荧光z投影，显示巨噬细胞（CD45，品红色）和内皮（CD31，绿色）之间的密切相互作用。比例尺，50微米。ECs，内皮细胞；LE，淋巴管内皮。有关统计和可重复性的详细信息，请参阅方法部分。图e中的图像使用BioRender创建（https://biorender.com）。源数据

Para_02

1. 我们的数据显示巨噬细胞对产前皮肤血管生成有贡献。
2. 与这一假设一致，我们在免疫缺陷的 SkOs 中观察到的内皮细胞数量较少且异质性较低，尽管形成了发育良好的毛囊、表皮和神经细胞（图 4b,c，扩展数据图 9b 和补充表 29）。
3. 推断轨迹分析显示，产前皮肤中的早期内皮细胞分化为动脉途径（毛细血管、毛细动脉和小动脉）或静脉途径（后毛细静脉和小静脉），表达特征基因（例如，GJA5 表达于动脉途径，PLVAP 表达于静脉途径）（图 4d 和扩展数据图 10a–c）。
4. 与 SkO 毛细动脉细胞不同，产前皮肤毛细动脉细胞能够进一步分化为小动脉（图 4d 和扩展数据图 10a）。
5. 与一个人类胚胎干细胞衍生和诱导多能干细胞衍生的血管类器官进行额外比较，该类器官也缺乏免疫细胞，进一步证明了这种中胚层导向的血管类器官模型的血管分化有限（扩展数据图 10d）。
6. 这一结果证实，免疫细胞对于完全再现体内内皮细胞的发展是必需的。

Para_03

1. 我们接下来研究了 SkO 内皮细胞扩张和分化失败的其他机制。
2. 与胎儿皮肤相比，SkO 中与血流和缺氧相关的基因和基因模块表达较低（扩展数据图 10e,f 和补充表 29）。
3. 然而，通过评估‘顶端’细胞状态来测定的萌芽血管生成潜力，在 SkO 毛细动脉细胞和胎儿皮肤的动脉、毛细动脉和毛细血管细胞中均有所增加（扩展数据图 10g,h）。
4. 这表明尽管强烈表达了萌芽血管生成的基因特征，SkO 毛细动脉细胞仍无法引导茎细胞形成新的血管。

Para_04

1. 抗血管生成基因（例如WNT5A）及其相应的受体在SkO中高表达，而促血管生成基因（例如CXCL8）在胎儿皮肤中上调，并主要由巨噬细胞表达（扩展数据图11a和补充表30-34）。
2. 尽管SkO细胞中血管内皮生长因子（VEGF）、VEGFA和VEGFB的表达增加，但它们的受体（KDR和FLT1）在SkO毛细动脉上的表达相比胎儿皮肤有所下调（扩展数据图11b,c）。
3. 这些受体是GATA2的已知下游靶点，GATA2在发育过程中对血管生成起关键作用，并调节体外VEGF诱导的内皮细胞迁移和萌发。
4. 调控子分析显示，GATA2及相关调控子（例如NFATC1）在SkO毛细动脉中的表达下调（扩展数据图11d,e）。
5. 几个GATA2和NFATC1的靶基因（例如VWF），这些基因在整个静脉轨迹伪时间中表达，并参与内皮细胞分化，在SkO毛细动脉中相比胎儿皮肤表达下调（扩展数据图11c,f）。
6. 正交方法（NicheNet）确定了巨噬细胞表达的VEGFA是调节胎儿皮肤与SkO内皮细胞之间GATA2表达差异的顶级上游配体之一（扩展数据图11g和补充表35-37）。
7. 这些发现表明，SkO中VEGF的高产生无法补偿缺失的巨噬细胞相关因素，这些因素驱动GATA2活性和下游VEGF受体的表达（图4e）。

Para_05

1. 接下来，我们在 SkO 分化早期引入了自体 iPSC 衍生的巨噬细胞，并在共培养第 35 天评估了内皮网络。
2. 即使在培养 5 周后，巨噬细胞仍与血管共定位。
3. 与没有巨噬细胞的对照组 SkO 相比，与巨噬细胞共培养的 SkO 显示出更复杂和有组织的血管网络。
4. 对照组 SkO 显示出内皮细胞的网状聚集，表现为 SkO 体积中内皮细胞覆盖密度较高，而在与巨噬细胞共培养的 SkO 中这种现象不存在。
5. 这种无序的血管网可能阻碍了内皮细胞的分离，从而无法进行单细胞 RNA 测序分析。
6. 我们还观察到，在 iPSC 衍生的内皮细胞与巨噬细胞共培养 72 小时的二维血管生成试验中，可见更精细的网络和内皮密度减少的趋势。
7. 综上所述，我们的研究结果表明，巨噬细胞与内皮细胞之间的相互作用对于通过血管重塑支持血管生成是必要的。

Discussion

Para_01

1. 在这项研究中，我们描述了人类胎儿皮肤在新毛囊形成早期阶段的动态组成，并突出了对皮肤形态发生有贡献的关键皮肤免疫和非免疫相互作用，这些结果与动物和人类研究中的新兴证据一致。
2. 我们的图谱表明，巨噬细胞有助于无疤痕皮肤修复、成纤维细胞稳态和神经血管发育。
3. 这部分是由卵黄囊来源的 TML 巨噬细胞贡献的，这表明这些细胞在早期妊娠中具有中枢神经系统以外的更广泛功能。
4. TML 巨噬细胞的存在之前已在多个胎儿器官中被识别。

Para_02

1. 在一些类器官系统中已经证明了与免疫细胞的成功共培养。
2. 我们发现，在含有毛发的iPS细胞衍生SkOs中加入巨噬细胞后，巨噬细胞在血管网络重塑中起着关键作用。
3. 这不仅对理解调节形态发生的多种细胞相互作用很重要，而且对体外模型也有实际意义，这些模型通常无法实现血管化。
4. 我们的研究进一步揭示了人类毛囊形成和CL起源的过程，后者似乎沿着与ORS相同的轨迹发展。
5. 这些发现与最近的小鼠研究结果一致，这些研究表明CL的发展发生在毛乳头形成之前，并且CL细胞与ORS细胞之间存在更大的转录相似性。
6. 尽管我们注意到人类和小鼠在协调毛囊形成的信号通路方面存在相似性，但我们的研究揭示了人类和小鼠毛囊间充质细胞分化速率的关键跨物种差异。
7. 未来的研究需要全面描述区分人类皮肤发育特征的不同之处。

Para_03

1. 成纤维细胞和巨噬细胞相关的分子特征可能有助于产前皮肤无疤痕愈合，包括成纤维细胞祖细胞的存在、免疫环境的下调和胶原蛋白表达减少。
2. 然而，我们发现早在妊娠9周就出现了‘老化’和成人‘促炎’表型的获得，这可以在成纤维细胞中作为靶标来指导产后无疤痕愈合。
3. 未来的研究需要将人类成纤维细胞亚群在整个生命周期中进行对齐，以研究无疤痕愈合的动力学以及机械力、微生物群和环境暴露对成纤维细胞功能的影响。

Para_04

1. 我们的人类胎儿皮肤图谱是一个宝贵的资源，用于探索导致先天性毛发和皮肤障碍的基因，并且可以免费从我们的网页门户访问（https://developmental.cellatlas.io/fetal-skin）。
2. 我们发现，确实存在这些基因在胎儿皮肤发育和毛囊分化期间表达，从而支持了这些障碍的子宫内起源。
3. 我们系统性的胎儿皮肤与皮肤器官型类器官（SkO）比较提供了蓝图，指导更忠实的体外 SkO 生成，这可以促进未来关于微生物群相互作用、先天性皮肤障碍的发病机制以及用于治疗应用的毛发和皮肤工程的研究，包括头发再生和皮肤移植。

Methods

Tissue acquisition and processing

组织获取与处理

Para_01

1. 本研究使用的人类发育组织样本来自由医学研究委员会和惠康信托基金资助的人类发育生物学资源（http://www.hdbr.org），已获得纽卡斯尔和北泰恩赛德 NHS 健康管理局联合伦理委员会（08/H0906/21+5）和英格兰东部-剑桥中央研究伦理委员会（NHS REC 96/085）的批准。
2. 用于免疫荧光成像蛋白质导致先天性皮肤病的产前皮肤样本是在盖伊和圣托马斯医院信托伦理委员会的批准下获得的。
3. 对于 Koehler 实验室用于三维渲染的样本，胎儿组织标本是从华盛顿大学的出生缺陷研究实验室获得的，该实验室已获得华盛顿大学机构审查委员会的批准，并且研究是按照波士顿儿童医院机构审查委员会的道德和法律指南进行的。
4. 所有样本均在怀孕选择终止或流产的情况下收集，事先已获得书面知情同意，并遵循所有相关规则和规定。

Para_02

1. 组织在接受后立即处理成单细胞悬浮液，用于单细胞转录组分析。
2. 首先将组织转移到一个无菌的10平方毫米组织培养皿中，并使用手术刀切成小于1立方毫米的片段。
3. 然后在含有10%热灭活胎牛血清（Gibco）的RPMI（Sigma-Aldrich）中，用IV型胶原酶（最终浓度为1.6毫克/毫升；Worthington）在37°C下消化30分钟，期间间歇性摇动。
4. 消化后的组织通过100微米的细胞筛网过滤。
5. 对于两个样本（F220，F221），向任何剩余未过滤的组织中进一步加入500微升0.25%的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich），并在室温下孵育5分钟。
6. 通过离心（500g，4°C，5分钟）收集细胞。
7. 细胞在室温下用1倍红细胞裂解缓冲液（eBioscience）处理5分钟，并在计数和抗体染色前用流动缓冲液（含5%（体积比）胎牛血清和2毫摩尔EDTA的PBS）洗涤一次。
8. 从18名年龄范围从7孕周到17孕周的捐赠者的皮肤中制备了单细胞悬浮液。

scRNA-seq experiment

单细胞RNA测序实验

Para_01

1. 解离细胞用抗CD45抗体（1:20，PE，克隆HI30，BD Biosciences；样本F220和F221）或1:33，BUV395，克隆HI30，BD Biosciences（其他分选样本）在冰上黑暗中染色30分钟，但一个样本（F217）未进行细胞分选。
2. 为了提高从CD45-部分捕获较少见的细胞群体，如角质形成细胞和内皮细胞，进行了额外的染色以将它们与丰富的CD34+间充质细胞区分开来，这在一部分样本中进行。
3. 对于样本F220和F221，使用了抗CD34抗体（1:25，APC/Cy7，克隆581，BioLegend）；对于样本F69和F71，额外的染色包括抗CD34抗体（1:25，APC/Cy7，克隆581，BioLegend）和抗CD14抗体（1:33，PE-CF594，克隆MφP9，BD Biosciences）。
4. 分选前立即，细胞通过35 µm滤器（Falcon），并加入DAPI（Sigma-Aldrich），最终浓度为3 μM。
5. 流式细胞术分选使用BD FACSAria Fusion流式细胞仪进行。
6. CD45+部分从DAPI-CD45+门分选，CD45-部分从DAPI-CD45-门分选。
7. CD45门连续设置，以便在分选过程中不丢失任何活细胞。
8. 活的CD45+和CD45-细胞分别分选到涂有FBS的冷却FACS管中。
9. 对于样本F220和F221，CD34+和CD34-部分分别从CD45-CD34+和CD45-CD34-门分选。
10. 对于样本F69和F71，除了活的CD45+和CD45-细胞外，还从CD45-部分分离出不在CD34+CD14-门内的所有细胞，并收集到涂有FBS的冷却FACS管中（扩展数据图1a）。

Para_02

1. FACS 分选的细胞悬液被计数并加载到 10x Genomics Chromium 控制器上，以实现每反应最多 10,000 个细胞的最大产量。
2. 使用了 10x Genomics 的 Chromium 单细胞 3′ 试剂盒（v.2）或 Chromium 单细胞 V(D)J 试剂盒。
3. 根据制造商的说明，将细胞加载到 Chromium 芯片的每个通道中，然后在 Chromium 控制器上进行液滴封装。
4. 根据制造商的说明生成基因表达和 TCR 文库。
5. 使用 Illumina 测序仪器对基因表达文库进行测序，以达到每个细胞至少 20,000 条读取的目标深度，对 TCR 文库进行测序，以达到每个细胞至少 5,000 条读取的目标深度。

Statistics and reproducibility

统计学与可重复性

Para_01

1. 苏木精和伊红染色皮肤切片（图2a）的图像取自以下孕周的13个独立样本：6孕周（n = 1和3个切片），8孕周（n = 3），11孕周（n = 2），14孕周（n = 1和2个切片），15孕周（n = 4）和17孕周（n = 2）。

Para_02

1. 对多重 RNAscope 和免疫荧光染色的图像分析是在每个实验的独立生物学和/或技术重复样本上进行的：对于带有 FOXP3、SHH、SLC26A7 和 NDP 探针的 RNAscope 幻灯片，n = 5 个生物学重复（图 2c）；
2. 对于带有 ACKR3、CXCL12、PDGFD 和 SERPINB7 探针的 RNAscope 幻灯片，n = 1 个生物学重复，4 个技术重复（图 2h）；
3. 对于带有抗 FOXP3、抗 SOX2 和抗 KRT14 的免疫荧光幻灯片，n = 3 个生物学重复，2 个技术重复（扩展数据图 3h）；
4. 对于带有抗 LYVE1、抗 CD45 和抗 VIM 的免疫荧光幻灯片，n = 1 个生物学重复，n = 2 个技术重复（图 3e）；
5. 对于带有 CDH5、CD68、P2RY12 和 ELAVL3 探针的 RNAscope 幻灯片，n = 3 个生物学重复（图 4a）；
6. 对于带有抗 CD45、抗 LYVE1 和抗 CD31 的免疫荧光幻灯片，n = 1 个生物学重复，4 个技术重复（图 4a）；
7. 对于使用以下抗体的胎儿皮肤免疫荧光幻灯片，n = 15 个生物学重复，至少 n = 2 个技术重复：抗 KRT1、抗 KRT14、抗 plectin、抗 BP180、抗 laminin-332 和抗 VII 型胶原（扩展数据图 6e）；
8. 对于使用抗 CD31 和抗 LYVE1 的胎儿皮肤全切片免疫荧光，n = 3 个生物学重复（图 4a）；
9. 对于与巨噬细胞共培养和不与巨噬细胞共培养的 SkO 全切片免疫染色，n = 5 个没有巨噬细胞的 SkO 和 n = 5 个有巨噬细胞的 SkO（图 4f）；
10. 对于与巨噬细胞共培养的 SkO 冷冻切片的免疫染色，n = 2 个 SkO（图 4h）。

Para_03

1. Visium空间转录组数据来自3个不同部位的n=4个生物样本，每个样本有2或3个技术重复（图2f和3d）。

Para_04

1. 划痕愈合实验在 SkO 来源的成纤维细胞上进行：n = 3，每次实验包括 3-6 个孔的技术重复（扩展数据图 8g）。
2. 数据表示为均值 ± 标准差，并使用带有 Tukey 多重比较检验的双向方差分析（ANOVA）生成统计结果。
3. 内皮细胞和巨噬细胞是在两个独立的分化批次中产生的。
4. 用于血管生成实验的内皮细胞和巨噬细胞共培养在 n = 6 个孔中进行（扩展数据图 11i）。
5. 数据表示为均值 ± 标准差，并使用非配对 t 检验生成统计结果。

Human iPS and ES cell line information

人源诱导多能干细胞和胚胎干细胞系信息

Para_01

1. iPS 细胞系 Kolf2.1S 是从 HipSci 计划通过材料转移协议获得的。
2. 该细胞系未进行独立验证。
3. 关于该细胞系生成和表征的详细信息可在 HipSci 网站（https://www.hipsci.org/#/lines/HPSI0114i-kolf_2）上获取。

Para_02

1. WTC-mEGFP-DSP-cl65 iPS 细胞系和 WA25 ES 细胞系是从 Coriell 或 WiCell 研究所通过材料转让协议获得的。
2. 这些细胞系在 SkO 分化前被确定具有正常的核型。

Para_03

1. 所有细胞系在实验前均检测为支原体阴性。

Scratch wound assay of fibroblasts in co-culture with macrophages

成纤维细胞与巨噬细胞共培养的划痕愈合实验

Para_01

1. 从 Kolf2.1S 衍生的 SkOs（n = 10）中分离成纤维细胞，时间点为第 76 天。简而言之，SkOs 用 dPBS 洗涤，然后在 37°C 下与分散酶和 ROCK 抑制剂共孵育 40 分钟。
2. 使用镊子将 SkO 的表皮和真皮层分开，并将真皮转移到 37°C 的胶原酶中 40 分钟。
3. 用成纤维细胞培养基中和胶原酶，单细胞悬液通过 40 µm 细胞筛过滤。
4. 离心 180g 3 分钟后，成纤维细胞被重新悬浮并接种在成纤维细胞培养基中，作为原代成纤维细胞进行培养。
5. 巨噬细胞由 Kolf2.1S iPS 细胞分化而来，具体方法如前所述。

Para_02

1. 对于划痕实验，成纤维细胞和巨噬细胞以 5:1 的比例接种在 48 孔板中，然后在 37°C 下孵育 24 小时。
2. 第二天，使用 p1000 移液枪头在每个孔的中心制造划痕。
3. 使用 Incucyte S3 和全孔模块对实验进行成像，并使用 ImageJ Wound_healing_size_tool_updated 宏进行分析。
4. 在 GraphPad 中进行了双因素方差分析以评估统计学意义。
5. 进行的划痕实验包括 3 次独立实验，每次实验有 3-6 个重复样本。

Visium spatial data generation

Visium空间数据生成

Para_01

1. 来自单一供体的10孕周的面部（n=1，重复=2）和腹部皮肤（n=1，重复=2）样本嵌入最佳切割温度（OCT）介质中，并在干冰冷却的异戊烷中快速冷冻。
2. 从OCT块中切下10微米的冰冻切片，置于10x Genomics Visium载玻片上。
3. 切片用苏木精和伊红染色，并在Hamamatsu Nanozoomer上以20倍放大率成像。
4. 然后根据10x Genomics Visium协议处理这些切片，使用通过先前组织优化步骤确定的12分钟渗透时间。
5. 按照制造商的协议准备双索引文库，合并至2.8 nM，并在Illumina Novaseq S4流动池中每流池8个样本进行测序，测序参数如下：读取1：28个循环；i7索引：10个循环；i5索引：10个循环；读取2：90个循环。

Endothelial cell and SkO co-culture with macrophages

内皮细胞和SkO与巨噬细胞的共培养

Endothelial cell culture co-culture and image acquisition

内皮细胞共培养及图像获取

Para_01

1. 内皮细胞来源于在 Matrigel 涂层板上使用含 ROCK 抑制剂的 mTeSR1 培养基培养的 Kolf2.1S iPS 细胞，密度为每平方厘米 4.5 × 10^4 个细胞。
2. iPS 细胞通过侧中胚层分化为 CD144+ 内皮细胞，如先前所述。
3. 巨噬细胞和 SkOs 也根据先前发表的方法从 Kolf2.1S iPS 细胞衍生而来。
4. 血管生成实验是通过将 iPS 细胞衍生的内皮细胞和巨噬细胞单独或共培养在 15 孔 3D 腔室 µ-slide (ibidi, 81506) 中进行的。
5. 这采用三层三明治方法，第一层是 10 µl Matrigel (Corning, 354230)，第二层是补充了 StemPro 培养基 (Gibco, 10639011) + 10% Matrigel，含有或不含内皮细胞，第三层是含有或不含巨噬细胞的补充了 StemPro 培养基。
6. 内皮细胞在 37 °C 下静置 4 小时后加入巨噬细胞。
7. 实验在初始培养 2 小时后开始成像，然后每隔 24 小时成像一次，持续 3 天，使用 EVOS 7000 显微镜，并使用 Fiji 版本的 ImageJ 软件 (v.2.14.0) 分析图像。
8. 共培养前，iPS 细胞衍生的巨噬细胞使用流式细胞术进行了表型分析 (扩展数据图 11h)。
9. 巨噬细胞使用 TrypLE (Gibco) 在 37 °C、5% CO2 条件下处理 5 分钟收集，细胞通过离心 (300g，6 分钟) 收集。
10. 细胞用细胞染色缓冲液 (BioLegend) 洗涤一次后进行计数和抗体染色。
11. 使用 Human TruStain FcX (Fc 受体阻断溶液，BioLegend) 在冰上阻断非特异性结合 10 分钟，然后使用 Fixable Blue Dead Cell Stain kit 在冰上染色 10 分钟 (1:500 在 PBS 中，ThermoFisher)。
12. 细胞用细胞染色缓冲液洗涤两次。
13. 细胞与抗 CD206 抗体 (1:200, PE, 克隆 19.2, ThermoFisher)，抗 CD16 抗体 (1:50, PE-Cyanine7, 克隆 eBioCB16, ThermoFisher)，抗 CD14 抗体 (1:100, PerCP-Cyanine5.5, 克隆 61D3, ThermoFisher)，抗 CD1c 抗体 (1:25, Pacific Blue, 克隆 L161, BioLegend)，抗 CD45 (1:300, BV480, 克隆 HI30, BD Biosciences) 和抗人谱系混合物 (1:100, CD3, CD19, CD20, CD56, 克隆 UCTH1, HIB19, 2H7, 5.1H11, BioLegend) 在暗处冰上孵育 30 分钟进行单染色。
14. 在分析仪上获取前，细胞用细胞染色缓冲液洗涤一次并通过 35 µm 过滤器 (Falcon) 过滤。
15. 流式细胞术获取使用 Cytek Aurora 完成。
16. 使用 FlowJo (v.10.9.0) 分析活的单个 CD16+，CD14+，CD206+，CD45+，CD1c– 和 Lin– 细胞。

SkO co-culture and image acquisition

SkO 共培养和图像获取

Para_01

1. 共培养通过在培养第12天将巨噬细胞按1:5的比例加入到SkOs中进行。
2. SkOs被转移到含有20%基质胶（Corning）的低吸附96孔板（Nunclon Sphera，Life Technologies）中的SkO成熟培养基中。
3. 巨噬细胞被加入到SkOs中，共培养物以100g离心6分钟，加速度1，减速度0。
4. 共培养第3天，细胞被转移到低吸附24孔板中，基质胶用新鲜的SkO成熟培养基稀释。
5. 共培养第35天（SkO分化第47天），SkOs在2毫升管中用4%多聚甲醛（PFA）过夜固定，用于整体连续染色（2批分化，含巨噬细胞的SkOs n=5，不含巨噬细胞的SkOs n=5）。
6. 然后，共培养物在室温下于摇床上在封闭缓冲液（0.3%（v/v）曲拉通X-100，1%（v/v）山羊正常血清和1% BSA（v/v）溶解于1×PBS中）中渗透8小时。
7. 然后，细胞在4°C摇床上（65转/分钟）与第一种一抗，针对巨噬细胞的抗CD45抗体（1:100，克隆YAML501.4，ThermoFisher）孵育过夜，持续48小时。
8. 次日早晨，细胞被洗涤，然后与第一种二抗（山羊抗大鼠IgG，Alexa Fluor Plus 647，ThermoFisher）孵育过夜。
9. 次日早晨，SkOs被洗涤，并与第二种一抗，针对内皮细胞的抗CD31抗体（1:100，克隆JC70A，Dako）孵育48小时。
10. 随后，SkOs被洗涤并与第二种二抗（山羊抗小鼠IgG1，Alexa Fluor 568，ThermoFisher）和DAPI在摇床上孵育过夜。
11. 细胞被洗涤并在室温下在摇床上置于50%甘油中30分钟。
12. 然后，细胞在室温下在摇床上转移至70%甘油过夜。
13. 次日早晨，共培养物使用定制的4相机旋转盘共聚焦显微镜安装和成像。
14. 该显微镜由OpenFrame显微镜框架连接到带有四个Teledyne Photometrics Kinetix相机的CrestOptics X-Light V3旋转盘共聚焦模块组成，由Cairn Research UK组装。
15. 所有类器官都在800微米深度使用奥林巴斯×10，0.3 NA空气物镜，5微米z步距拍摄了拼接堆栈图像。
16. 然后使用Bigstitcher将拼图缝合以生成最终图像。
17. 由于样品架两侧都是透明的，每个类器官都被从两个方向各成像一次。

Image analysis of endothelial cells and SkOs co-cultured with macrophages

内皮细胞和SkOs与巨噬细胞共培养的图像分析

Image analysis of endothelial cell culture

内皮细胞培养的图像分析

Para_01

1. 为了量化内皮细胞在有无巨噬细胞的2D血管生成试验中覆盖的面积，使用ImageJ软件（v.2.14.0）的Fiji版本分析了培养24、48和72小时的孔的相衬图像。
2. 内皮细胞的面积是通过测量所有细胞覆盖的孔面积来估计的（即只有内皮细胞或内皮细胞与巨噬细胞共存的情况）。
3. 为了获得内皮细胞密度（百分比），在分割后使用强度阈值测量覆盖的细胞面积，并将其归一化到总成像面积（恒定，2,115,570像素）。

Image analysis of SkO culture

SkO培养的图像分析

Para_01

1. 为了量化有和没有巨噬细胞的类器官上内皮细胞覆盖的面积，使用了 ImageJ 软件（版本 2.14.0）的 Fiji 分发版分析了 CD31+ 染色的共聚焦堆栈的最大强度 z 投影。
2. 在使用强度阈值分割后，测量了 CD31+ 内皮细胞的面积（单位：µm²），并将其归一化到类器官的面积（单位：µm²），以获得内皮密度（百分比）。
3. 每个点代表一个类器官的内皮密度。
4. 分析的堆栈包含 161 或 201 个切片，每个切片在 z 维度上的厚度为 1 µm，在 x 和 y 维度上的最大尺寸为 1,415 µm × 1,415 µm。
5. 它们的最大强度 z 投影覆盖的总面积范围为每类器官 1.86 至 14.74 百万 µm²。

Whole-mount immunostaining of human prenatal skin sample

人胚胎皮肤样本的整体免疫染色

Para_01

1. 对于产前组织样本，用 PBS 洗涤一次后，在室温下于摇床上使用新配制的 4% PFA 溶液（1× PBS）固定半小时。
2. 经过三次 PBS 洗涤后，将样本置于 LifeCanvas Technologies 公司的 SH-Ex 冷 12.5% SHIELD 环氧溶液中，并在 SH-BS SHIELD 缓冲液中轻轻摇动 2 天，温度为 4°C。
3. 接下来，将样本转移到 SH-ON SHIELD 加热溶液中，在温和摇床上于 37°C 下处理 2 小时。
4. 随后，在新鲜的 1× PBS 中进行 8 小时的广泛洗涤（每小时更换一次），并在 55°C 下使用 SHIELD 去脂缓冲液（DB）进行 24 小时的去脂步骤，之后在室温下的 PBST（含 0.1% Triton X-100 和 0.02%叠氮化钠的 PBS）中洗涤一天。
5. 然后，在室温摇床上过夜应用抗 CD31（1:100，克隆 C31.3，Novus Biologicals）和抗 LYVE1（1:50，多克隆，Novus Biologicals）一抗，缓冲液为 0.1% PBST。
6. 经过 3 小时的三次 0.1% PBST 洗涤后，样本在室温摇床上与以下二抗孵育 4 小时：山羊抗小鼠 IgG1，Alexa Fluor 488（ThermoFisher）和山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 647（ThermoFisher）。
7. 之后，再进行三次 0.1% PBST 洗涤。
8. 成像前，样本在 37°C 下用 Easy-Index 匹配溶液（LifeCanvas Technologies, EI-Z1001）与 1× PBS 的 1:1 溶液中调节 4 小时，随后替换为 100% 浸没介质，在 37°C 下至少保持 6 小时。
9. 使用尼康 A1R HD25 激光共聚焦显微镜系统进行成像。

3D rendering

三维渲染

Para_01

1. 使用 Imaris 10 软件在波士顿儿童医院细胞成像核心创建了 3D 体积渲染和分割。
2. 对于补充视频 1，CD31+ 血管和 LYVE1+ 巨噬细胞使用 Imaris 的 'Surfaces' 模块处理。
3. CD31 和 LYVE1 通道的共定位使用 'Coloc' 功能处理，生成了一个单独的重叠信号通道。
4. Coloc 功能中使用的参数取决于信号重叠和 CD31 和 LYVE1 通道的紧密接触，导致标记为共定位表面的区域比血管和巨噬细胞的实际接触点更大。
5. 分类基于估计的大小和机器学习训练。
6. 用于 CD31+ 内皮细胞的构建参数如下：面积大于 11.0 µm²；对于 LYVE1+ 巨噬细胞：'体素数 Img=1' 大于 953；对于共定位表面：面积大于 1,004 µm²；过滤类型 '重叠体积比至表面 surfaces=LYVE1' 阈值=0.00976。

Immunofluorescence of prenatal skin and SkO cryosections

产前皮肤和SkO冷冻切片的免疫荧光

Para_01

1. 从胎盘皮肤样本或在 OCT（Tissue-Tek OCT）中冷冻的 iPS 细胞衍生的 SkOs 获得 10 微米的冰冻切片。
2. 获得的载玻片存放在 -80 °C 直至使用。
3. 实验当天，将载玻片解冻并在室温下干燥，然后在 1× PBS（Alfa Aesar, J61899）中的 4% PFA 溶液中固定 10 分钟。
4. 用 1× PBS（Gibco, 10010-015）洗涤载玻片，并在室温下用每张载玻片 120 微升的封闭溶液（在含 0.1% Triton X-100（Millipore, 648466）的 1× PBS 中制备的 3% 山羊血清）孵育 1 小时。
5. 然后在 4 °C 下，在封闭溶液中每张载玻片应用 120 微升的一抗过夜（一抗列表见补充表 38）。
6. 第二天，用 1× PBS 洗涤载玻片 3 次，然后在室温下用每张载玻片 120 微升的二抗（在封闭溶液中制备，见补充表 38）孵育 1-2 小时。
7. 用 1× PBS 洗涤载玻片三次，并在 1× PBS 中制备的 1 微克/毫升 DAPI 溶液中孵育。
8. 最后用 1× PBS 洗涤后，用 ProLong Gold Antifade 封片剂（ThermoFisher, P36930）封片。
9. 载玻片在黑暗中室温下干燥过夜，并使用 Leica SP8 共聚焦显微镜成像。

Multiplex RNAscope staining and image analysis

多重RNAscope染色和图像分析

Para_01

1. 妊娠期皮肤组织（8、10 和 15 周胎龄）在 OCT 化合物（Tissue-Tek OCT）中冷冻。
2. 使用 RNAscope 多重荧光检测试剂盒 v.2（ACDBio, 323100）或 RNAscope LS 多重荧光试剂盒 v.2 和 RNAscope LS 4-重辅助试剂盒进行 4-重单分子荧光原位杂交（smFISH），按照制造商的说明操作。
3. 对 10–20 微米的新鲜冰冻切片进行了标准预处理，并在室温下用蛋白酶 IV 渗透 30 分钟。

Para_02

1. 使用了针对 FOXP3、SHH、SLC26A7、NDP、CDH5、CD68、P2RY12、ACKR3、CXCL12、PDGFD 和 SERPINB7 转录本的人类探针（所有来自 ACDBio 目录探针）。
2. Opal 染料（Akoya Biosciences）在荧光步骤中用于开发每个通道时稀释比例为 1:1,000：Opal 520 试剂盒（FP1487001KT），Opal 570 试剂盒（FP1488001KT）和 Opal 650 试剂盒（FP1496001KT）以及 Atto-425。
3. 最后，载玻片用 DAPI 进行复染，并用 ProLong Gold Antifade 封片剂（ThermoFisher, P36930）封片以进行成像。

Para_03

1. 使用 Perkin Elmer Opera Phenix Plus 高内涵筛选系统，通过数值孔径为 1.1、每像素 0.149 微米的 40 倍水浸物镜，以 2 微米 z 步长对含有 FOXP3、SHH、SLC26A7、NDP、CDH5、CD68 和 P2RY12 探针的 4-plex RNAscope 滑片进行了成像。
2. 使用的通道包括：DAPI（激发波长 375 纳米，发射波长 435-480 纳米）；Atto 425（激发波长 425 纳米，发射波长 463-501 纳米）；Opal 520（激发波长 488 纳米，发射波长 500-550 纳米）；Opal 570（激发波长 561 纳米，发射波长 570-630 纳米）；和 Opal 650（激发波长 640 纳米，发射波长 650-760 纳米）。
3. 使用 Perkin Elmer 提供的专有 Acapella 脚本将共聚焦图像堆栈拼接为 2D 最大强度投影，并使用 OMERO Plus（Glencoe Software）进行可视化。

Para_04

1. 使用与类器官3D成像相同的定制旋转盘共聚焦显微镜，对含有ACKR3、CXCL12、PDGFD和SERPINB7探针的4重RNAscope切片进行了成像。
2. 使用的物镜是尼康CFI Plan Apochromat Lambda D（数值孔径0.95）的40倍物镜。
3. 成像采用1.5 µm的z轴步长，并使用Bigstitcher Fiji插件进行拼接，以从单个图块生成最终的z轴投影图像，用于分析。

Para_05

1. 使用 QuPath 图像分析软件（v.0.5.1）进行了 FOXP3 覆盖量的量化。
2. 训练了两个像素分类器：一个用于将组织从图像背景中分割出来，另一个用于将 FOXP3 斑点从背景中分割出来。
3. 所有毛囊区域都是从整个皮肤切片图像中手动分割出来的。
4. 从整个皮肤组织掩模和毛囊掩模之间的差异自动生成了一个新的分割掩模。
5. 然后通过计算被分割出的 FOXP3 斑点占据的掩模百分比，分别计算了毛囊区域和皮肤组织中的 FOXP3 覆盖率。

scRNA-seq data analysis

单细胞RNA测序数据分析

Alignment, quality control, clustering and annotation of prenatal skin dataset

产前皮肤数据集的对齐、质量控制、聚类和注释

Para_01

1. 基因表达数据使用 CellRanger（v.2.1.1 和 v.2.0.2）映射到基于 Ensembl 84 的 GRCh38 参考序列（10x Genomics 分发的 v.1.2.0 版本）。
2. 使用 Python 包 emptydrops（v.0.0.5）检测每个样本中的细胞。
3. 使用 Scrublet（v.0.2.1）标记潜在的双细胞，如先前描述的方法。
4. 首先通过使用线粒体 UMI 比例的中位数 + （X × MAD）得分（其中 MAD 是中位数绝对偏差）进行低质量细胞过滤，包括线粒体 UMI 比例的中位数得分（5 × MAD），UMI 数量的最大值（8 × MAD），随后应用严格的截止值（最小基因数 = 200，最大 UMI 数量 = 50,000，最大线粒体 UMI 比例 = 0.20）。
5. 使用 souporcell 流程（v.2.4.0）识别可能的母源污染（总共 118 个细胞），如先前描述的方法。
6. 简而言之，样品按供体基础汇集，并用 souporcell 处理。
7. 使用了 souporcell 作者提供的常见 GRCh38 变异文件（来自 1k 基因组的频率≥2% 的 SNP）。
8. 该流程运行两次，将基因型聚类设置为 1 和 2，以获得没有母源污染和可能有母源污染的模型。
9. 使用贝叶斯信息准则（BIC）确定更好的模型，计算公式为 BIC = kn log(m) − 2l，其中 k 是每次 souporcell 运行设置的基因型聚类数量，n 表示用于基因型解卷积的位点数量，m 是给定供体的细胞计数，l 是运行管道后获得的对数似然性。
10. 识别出次要基因型的细胞作为可能的母源污染物。
11. 使用 scanpy（v.1.4.3）进行数据预处理。
12. 汇集所有样本的数据后，移除检测到少于三个细胞的基因，并将数据归一化为每细胞 1 × 10^4 UMI，并进行 log1p 转换。

Para_02

1. 根据标准化分散度（使用 scanpy.pp.highly_variable_genes，参数设置为 flavor='seurat'，min_mean=0.0125，max_mean=3，min_dispersion=0.5）选择了高变异基因。
2. 使用主成分分析进行降维，并使用前50个主成分来计算最近邻图（使用 scanpy.pp.neighbors，参数设置为 n_neighbors=15）。
3. 使用 scvi-tools 中的 scVI 模块（版本 0.19.0）校正供体和 10x 套件版本批次效应（HVG=15000，dropout_rate=0.2，n_layer=2）。
4. 使用 Leiden 算法基于校正后的图以相对较低的分辨率（使用 scanpy.tl.leiden，参数设置为 resolution=0.3）将细胞聚类成粗略的簇，并使用已知标记基因手动注释为广泛的谱系。

Para_03

1. 对于每个广泛的谱系，数据从高度可变基因选择开始重新处理，以更好地揭示更细的异质性。
2. 在这个层面上，我们使用了 Harmony（v.0.0.5）和 scVI（来自 scvi-tools v.0.19.0）并行进行批次校正（再次将每个供体视为单独的批次），针对每个广泛的谱系进行了处理，并观察到高度一致的嵌入和聚类（数据已提供在门户上）。
3. Leiden 聚类在最高分辨率下通过手动注释标记基因进行标注，这些基因是通过文献搜索识别的，以及它们在每个聚类中的独特差异表达基因（DEGs）的表达，例如 WNT2+ 成纤维细胞中的 WNT2 表达。
4. 每个聚类的 DEGs 完整列表见补充表 3。
5. DEGs 使用 sctk（单细胞分析工具包）软件包（https://github.com/Teichlab/sctk）计算，其中过滤后使用通过过滤的基因进行双边 Wilcoxon 秩和检验，采用一对一的方式。
6. sctk 软件包还执行了兴趣组（表达最高的组）与下一个组（第二高表达的组）之间的比较，其中在第二高表达组中表达该基因的细胞的最大比例为 0.2。
7. 对于表皮注释，我们创建了一个结合产前皮肤和 SkO 数据的综合嵌入图，使用 Harmony 流程进行整合，以及与成人毛囊的整合以检查注释，如下所述。
8. 使用 Harmony 校正的主成分计算批校正最近邻图，并使用 Leiden 算法对整合数据进行聚类。
9. 然后使用 sctk 软件包为每个 Leiden 聚类推导 DEGs。
10. 基于标记基因和 SkO 数据中的细化注释对聚类进行了注释。

Para_04

1. 双细胞簇被手动标记并移除，考虑了标志基因和先前计算的 scrublet 分数。
2. 为了获得图谱的最终全局可视化，生成了一个无双细胞的 UMAP（图 1b）。

Processing, clustering and annotation of SkO dataset

SkO数据集的处理、聚类和注释

Para_01

1. 类器官数据在与产前皮肤整合之前分别进行了预处理、过滤、聚类和注释。简而言之，从 SkO 样本（2 个品系，每个品系 4 个时间点）中通过 CellRanger（使用 CellRanger 2.1.0 和 GRCh38-1.2.0 以及 CellRanger 3.0.2 和 GRCh38-3.0.0）筛选出的细胞被汇集，并针对 UMI 数量、基因数量、线粒体基因百分比和前 50 个高表达基因建立了质量控制阈值，方法是分别拟合高斯混合模型到每个度量的分布。
2. 使用的阈值如下：最小基因数 = 450，最大基因数 = 5,731，最小 UMI 数 = 1,063，最大 UMI 数 = 25,559，最大线粒体 UMI 比例 = 0.133，单个细胞中前 50 个最表达基因的计数累积百分比最小值 = 23.7%，单个细胞中前 50 个最表达基因的计数累积百分比最大值 = 56.6%。
3. 高度变异基因选择、降维和 KNN 图构建采用与产前皮肤相同的方法和参数进行。使用 BBKNN（v.1.3.390）进行批次校正，将品系组合和 10x 套件版本视为批次。
4. 根据已知标记物对广泛的谱系进行了注释。然后，每个广泛的谱系以与产前皮肤相同的方式重新处理，以更高分辨率注释细胞类型。

Integration of prenatal skin and SkO datasets

产前皮肤和SkO数据集的整合

Para_01

1. 使用 Harmony（v.0.0.5）整合了产前皮肤细胞和类器官细胞，将数据集视为批次（产前皮肤或类器官），并在数据集批次内作为协变量处理（产前皮肤的供体，SkO 的品系，以及两个数据集的 10x 套件版本）。
2. Leiden 聚类使用已知标记进行注释。

Comparison of prenatal skin, adult skin and SkO datasets: distance-based analysis

产前皮肤、成人皮肤和SkO数据集的比较：基于距离的分析

Para_01

1. 使用 Harmony（v.0.0.5）整合了产前皮肤、成人皮肤和 SkO 细胞，将数据集视为批次，并将数据集内的批次视为协变量（产前和成人皮肤的数据集供体，类器官的数据集品系，所有数据集的 10x 套件版本）。
2. 然后使用降采样的 Harmony 整合对象的主成分向量来转换非降采样池数据中所有细胞的基因表达矩阵（NumPy（v.1.23.4）函数‘linalg.lstsq’，rcond = ‘warn’），并用于 UMAP 可视化（图 1e 和扩展数据图 2a）。
3. 使用每个广泛细胞簇的中位数转换基因表达来计算产前皮肤、成人皮肤和 SkO 之间的欧几里得距离，使用 SciPy（v.1.9.3）中的‘spatial.distance_matrix’函数，然后将其绘制为热图（扩展数据图 2c）。

Time-encoded cell state predictions: prenatal skin, adult skin and SkO datasets

时间编码的细胞状态预测：胎儿皮肤、成人皮肤和SkO数据集

Para_01

1. 在单细胞数据集中，基因表达矩阵之间的类别对应概率的中位数是使用逻辑回归（LR）框架进行的，该框架以前已描述过，基于与CellTypist工具类似的流程。
2. 首先将注释的原始scRNA-seq数据集（胎儿皮肤、成人皮肤和SkO）合并、标准化并进行对数转换。
3. 使用scvi-tools中的LDVAE模块计算线性变分自编码器（VAE）的潜在表示（隐藏层=256，dropout率=0.2，重建损失=负二项式），并将数据集和化学信息作为技术协变量考虑。
4. 使用sklearn包（v.0.22）中的linear_model.LogisticRegression模块构建了ElasticNet LR模型。
5. 模型在SCVI批处理校正的低维LDVAE训练数据表示上进行训练（胎儿和成人皮肤），使用时间编码标签（年龄_细胞类别）。
6. 使用sklearn（v.1.1.3）中的GridSearchCV函数调整正则化参数（L1比率和alpha）。
7. 测试网格设计包括五个l1_ratio区间（0.05, 0.2, 0.4, 0.6 和 0.8），五个alpha（正则强度的倒数）区间（0.05, 0.2, 0.4, 0.6 和 0.8），以及五次训练-测试分割和三次重复用于交叉验证。
8. 使用每个测试折叠的加权均方误差（MSE）的未加权平均值（交叉验证MSE）来确定最佳模型。
9. 所得模型用于预测训练的时间编码标签与目标数据集（SkO）中预先标注的时间编码簇（培养周数_细胞类别）之间的对应概率。
10. 计算了每个预设类别的整体（所有细胞组）和个别广泛细胞类别的训练标签分配的中位概率（补充表5）。
11. 为了可视化，成人皮肤数据集被随机采样至10%（总体或按细胞谱系），并将训练和目标数据集标签之间的LR概率关系绘制为热图（扩展数据图2d）。

Differential abundance analysis

差异丰度分析

Para_01

1. 与胎龄相关的细胞丰度差异使用 Milo（v.1.0.0）进行了测试，校正了 CD45+ 和 CD45– FACS 分离策略。
2. 我们首先使用 scVI 模型将细胞重新嵌入到一个维度为 30 的批次校正潜在空间中，该模型在 scvi-tools 中实现，并考虑供体和化学作为批次。
3. 模型使用基于分散性（min_mean = 0.001, max_mean = 10）选择的 15,000 个最具可变性的基因进行训练，如前所述。
4. 当应用 FACS 校正时，我们计算了每个样本 s 使用门 i 排序的 FACS 分离校正因子 (fs = log(piS/Si))，其中 pi 是来自门 i 的细胞的真实比例，S 表示两个门的总细胞数。
5. 基于潜在空间中的距离构建了细胞的 KNN 图，并使用 milopy.core.make_nhoods 函数 (prop = 0.1) 将细胞分配到邻域。
6. 然后统计每个邻域中每种细胞类型的细胞数量 (milopy.core.count_nhoods)。
7. 根据频率 (>50%) 的细胞标签多数投票 (milopy.utils.annotate_nhoods) 为每个邻域分配标签。
8. 为了测试胎龄对细胞丰度的影响，将产前皮肤数据分为 4 个年龄组（7-8 周、9-10 周、11-13 周和 15-17 周），并使用负二项广义模型建模细胞计数，采用 Benjamini-Hochberg 加权校正，如前所述，以测试年龄（年龄组）以及细胞排序校正（milopy.core.DA_nhoods）的效果。
9. 使用 (SpatialFDR < 0.1, log(倍变化) < 0) 检测早期富集的显著差异丰度邻域，使用 (SpatialFDR < 0.1, log(倍变化) > 0) 检测晚期邻域（补充表 4）。

Cell state predictions: adult HFs, embryonic macrophages, blood vessel organoid, reindeer skin

细胞状态预测：成年 HF、胚胎巨噬细胞、血管类器官、驯鹿皮肤

Para_01

1. 为了将产前皮肤细胞与外部数据集（成人毛囊、胚胎巨噬细胞、血管类器官、驯鹿皮肤）进行比较，这些数据集被下采样以使每种注释细胞类型的细胞数量大致平衡，然后使用 Harmony（v.0.0.5）整合，将数据集视为批次，并在数据集批次内作为协变量处理（产前皮肤的供体、胚胎巨噬细胞的部位、血管类器官的组（细胞系：培养天数）、驯鹿皮肤的化学性质）。

Para_02

1. 使用类似于 CellTypist 包的 LR 框架对数据集之间的细胞类型对应关系和概率预测进行了比较。
2. 使用 sklearn 包（版本 1.1.3）中的 linear_model.LogisticRegression 模块实现构建了一个模型（参数：惩罚项：L2，求解器：saga，正则化强度 C = 0.1），并在训练数据集的基因表达矩阵上使用所有通过质量控制的基因进行训练。
3. 所得到的模型用于预测目标数据集中的类别。
4. 计算目标数据集中预测类别与原始类别之间的对应关系，采用 Jaccard 指数和中位数概率预测，并以热图形式可视化。
5. 为了比较胎儿皮肤巨噬细胞与胚胎巨噬细胞，使用胚胎巨噬细胞数据集作为训练数据，胎儿皮肤巨噬细胞作为查询；为了比较血管类器官与胎儿皮肤，使用胎儿皮肤数据集（每种细胞类型最多下采样至 500 个细胞）作为训练数据，血管类器官数据作为查询；为了比较 HF 数据，合并的胎儿和类器官数据用作训练数据，成人数据集作为查询；为了比较胎儿皮肤成纤维细胞和巨噬细胞与驯鹿皮肤成纤维细胞和巨噬细胞，使用驯鹿皮肤数据子集作为训练数据，胎儿皮肤数据子集作为查询。

Cross-species comparison: prenatal skin and mouse skin datasets

跨物种比较：人类产前皮肤与小鼠皮肤数据集

Para_01

1. 使用先前描述的方法，基于类似于 CellTypist 工具的工作流程，通过 LR 框架计算了人和小鼠皮肤单细胞数据集之间类别的中位概率。
2. 首先将注释的原始 scRNA-seq 数据集（人类胎儿皮肤和小鼠胚胎皮肤）连接、标准化、对数转换，并根据分散度筛选出前 5,000 个高变基因（批次键=数据集）。
3. 使用 scvi-tools 计算了 VAE 隐变量表示（最大轮数=400，批量大小=512），并将物种、数据集和化学信息作为分类协变量。
4. 使用 sklearn 包（v.0.22）中的 linear_model.LogisticRegression 模块构建了 ElasticNet LR 模型。
5. 模型在 SCVI 批次校正的低维 VAE 表示的训练数据（胎儿皮肤）上进行了训练，用于广泛细胞分组和细化细胞注释。
6. 所得模型用于预测训练的胎儿皮肤标签与目标小鼠皮肤数据中的预注释簇（广泛细胞分组和细化注释）之间的对应概率。
7. 计算了训练标签分配的中位概率（补充表 10 和 11）。
8. 为了可视化，将训练和目标数据集标签之间的 LR 概率关系绘制为热图。

FRZB comparison across developing organs

不同发育器官间的 FRZB 比较

Para_01

1. 为了比较发育器官中纤维细胞的 FRZB 基因表达，使用了来自多个发育器官的单细胞 RNA 测序基质数据集（可从人类发育细胞图谱（https://developmental.cellatlas.io/fetal-immune）获取），该数据集还包括我们的产前皮肤单细胞 RNA 测序数据。
2. 数据被归一化为每个细胞 1 × 10^4 计数（scanpy.pp.normalize_total），进行了 log1p 转换（scanpy.pp.log1p），并仅选择了纤维细胞类型来绘制整个妊娠期间各器官的 FRZB 表达情况。

Trajectory analysis

轨迹分析

Para_01

1. 使用 CellRank 包（v.1.5.2）定义了细胞转换矩阵、谱系驱动因子和终端状态转换的命运概率，这些转换是在结合了产前皮肤和 SkO 的嵌入中针对角质形成细胞和成纤维细胞进行的，同时也在产前皮肤中针对内皮细胞进行了分析。
2. 使用 scVelo 包（v.0.3.0）中的 pp.moments（n_pcs=10, n_neighbours=30），推断了一阶动力学矩阵。
3. 使用 CellRank 中的 palantir 核和速度核，计算了一个混合概率转换矩阵，其中 palantir 核权重为 70%，速度核权重为 30%。
4. Schur 矩阵特征分解（n_components=25, method='brandts'）识别了宏观状态、终端阶段和初始阶段。
5. 然后使用 CellRank 的 compute_lineage_drivers 计算了每个状态的谱系驱动因子，并在 scVelo 中计算了伪时间和潜在时间（补充表 7）。

In vivo–in vitro trajectory alignment analysis

体内-体外轨迹对齐分析

Para_01

1. 我们使用基于动态规划的对齐方法来评估胎儿皮肤和SkO成纤维细胞单细胞轨迹之间的一致性，这些轨迹描述了从HOXC5+早期成纤维细胞到Dp的体内和体外分化谱系。
2. 基因到基因（G2G）是一个贝叶斯信息论动态规划框架，能够一致地捕捉两个轨迹在基因水平和细胞水平上的匹配和不匹配。
3. G2G输出一个最优轨迹对齐，描述了体内和体外伪时间点的非线性映射，按顺序排列。
4. 这是基于每对类器官-参考时间点的基因表达分布匹配或不匹配的成本计算得出的，该成本作为两种假设下最小消息长度标准下的熵差统计量。
5. 这个统计量是香农信息距离，以信息单位nits计算。
6. 给定任意一组基因，G2G为每个基因运行动态规划对齐，输出一个五状态对齐字符串，涵盖体内和体外伪时间点之间的匹配（一对一/一对多/多对一）和不匹配（插入和删除-空位），按顺序排列，类似于DNA/蛋白质对齐输出。
7. 然后，它计算每个基因的对齐相似性度量（即对齐字符串中的匹配百分比）（补充表9）。
8. 这些对齐字符串使我们能够识别具有不同对齐模式的不同基因簇。
9. G2G还生成所有基因级对齐的聚合细胞级对齐，从而得到总体对齐相似性度量。
10. 这种聚合对齐反映了时间点在基因平均上是否匹配或不匹配（即，如果两个轨迹之间特定时间点对的基因级对齐比例较高，则平均对齐将它们包括为匹配）。

Para_02

1. 使用 G2G，我们检查了体内参考与体外查询对齐情况，涉及 1,369 个人类转录因子。
2. 这些转录因子是在过滤掉零表达基因和少于十个细胞中表达的基因后选取的。
3. 给定参考和类器官细胞的 log1p 归一化基因表达矩阵以及使用 CellRank 计算的伪时间估计，G2G 生成了完整的描述性转录因子水平对齐，以及跨这些转录因子水平对齐的聚合细胞水平对齐。
4. 在对齐之前，参考和类器官轨迹在伪时间轴上被等长间隔离散化。
5. 注意，离散伪时间点的数量是根据 OptBinning 预测的最佳分箱结构确定的，基于它们的伪时间估计分布，确定为 15 个点。
6. 还应注意，在每次对齐时，这些离散的时间点是匹配或不匹配的。
7. 对于单个数据集中每个转录因子轨迹的每个离散时间点，G2G 估计其表达分布为高斯分布，其中加权均值和加权方差是通过所有细胞计算得出的（即，每个细胞对这一估计的贡献是基于它们到特定时间点的距离，采用高斯核权重插值方法）。
8. 接下来，在使用 15 个离散时间点插值参考和类器官轨迹后，为每个转录因子运行动态规划对齐，并使用 G2G 函数对转录因子水平对齐输出进行凝聚层次聚类，识别出不同对齐模式的转录因子簇（即，早期不匹配、中期不匹配、晚期不匹配和完全不匹配）。
9. 该函数在转录因子水平对齐输出上运行凝聚层次聚类。

Cell–cell interaction analysis

细胞间相互作用分析

Para_01

1. 使用 CellPhoneDB (v.3.0.0) 包100 推断了整个产前皮肤 scRNA-seq 数据集以及早期/晚期妊娠和整个 SkO scRNA-seq 数据集中的细胞-细胞相互作用。
2. 在总体分析中，我们随机将每种细胞类型抽样到不超过 200 个细胞，共进行 3 次抽样，如果某个群体少于 200 个细胞，则使用所有细胞，并排除少于 10 个细胞的群体。
3. 使用基于排列的方法对抽样的数据集分别进行分析以确定显著性（P 值截止点 = 0.05）。
4. 对于按早期/晚期妊娠的分析，首先将产前皮肤 scRNA-seq 数据集分为早期（≤11 孕周）和晚期（≥12 孕周）妊娠数据集，然后每个细胞类型抽样不超过 200 个细胞，并分别进行分析（P 值截止点 = 0.05）。
5. 为每次分析运行创建了一个汇总输出文件，汇编了每对细胞之间的相互作用（P < 0.05），并对多重检验进行了 P 值调整（FDR 设定为 0.05）。
6. 使用 Circos 图（Circlize 包 (v.0.4.15)）对选定的显著（调整后的 P 值 < 0.05）相互作用进行下游可视化，这些相互作用是在所有抽样分析中发现的共同定位细胞类型之间的相互作用。

Para_02

1. 为了探索巨噬细胞亚群与内皮细胞之间的推断相互作用（扩展数据图 9a），我们通过平均各巨噬细胞亚群和不同类型的内皮细胞（早期内皮细胞、小动脉、毛细血管前小动脉、毛细血管、毛细血管后小静脉和小静脉）的预测相互作用的均值，并使用调整后的 P 值的最小值，如前所述进行了汇总。
2. 使用 ggplot2（v.3.3.6）绘制了汇总的相互作用列表以进行可视化。
3. 对于评估胎皮中毛囊真皮和表皮细胞之间的相互作用采用了类似的方法：对于每个毛囊真皮细胞亚群，与早期上皮细胞（≤11 周妊娠；未成熟基底）或晚期上皮细胞（≥12 周妊娠；DPYSL2+ 基底，POSTN+ 基底，原板，基质，ORS，CL，IRS，角质层/皮质）的相互作用被汇总，每对细胞的前 10 个相互作用使用热图进行了可视化（图 2g）。
4. 同样的分析也用于获取 SkO 毛囊中的前 10 个相互作用（扩展数据图 5c），定义早期/晚期以匹配与胎皮中相应的细胞状态。
5. 在胎皮毛囊中识别出的前 10 个相互作用也在 SkO 数据中绘制，以突出两者之间的相似性和差异（图 2g）。

Comparison with adult fibroblasts

与成纤维细胞的比较

Para_01

1. 整合了来自胎儿皮肤和成人健康皮肤（带有原始注释）的单细胞 RNA 测序数据，并将其子集化为感兴趣的细胞组（成纤维细胞）。
2. 使用 scanpy 中的 Wilcoxon 秩和检验实现方法计算成人与胎儿皮肤成纤维细胞之间的差异表达基因，并使用 Benjamini-Hochberg 方法进行多重检验校正（scanpy.tl.rank_genes_groups, method = "wilcoxon", corr_method = "benjamini-hochberg"）。
3. 使用 Python 包 GSEApy (https://gseapy.readthedocs.io/; v.0.10.7) 中的 Enrichr 工作流实现，根据得分对每组排名前 1,000 的基因进行了基因集富集分析，查询数据库为 Gene Ontology Biological Process (2021)（补充表 14, 15）。
4. 选择了一部分基因进行绘制，以突出胎儿和成人皮肤成纤维细胞之间的差异。

Gene set enrichment analysis

基因集富集分析

Para_01

1. 为了确定基因集富集分析中显著过表达的基因，我们首先使用 Scanpy 中的 Wilcoxon 秩和检验实现（scanpy.tl.rank_genes_groups，method = 'wilcoxon'）识别了每个感兴趣的细胞组（髓系细胞）之间细胞类型的差异表达基因（DEGs）。
2. 差异表达对数（折叠变化）> 1.5 且调整后的 P 值 < 0.01 的基因被认为是显著过表达的。
3. 基因集富集分析使用 Python 包 GSEApy（https://gseapy.readthedocs.io/；v.0.10.7）中的 Enrichr 工作流实现，以 Gene Ontology 生物过程（2023）和 Molecular Signatures Database (MSigDB) 标志（2020）作为查询数据库。

Para_02

1. 为了比较早期和晚期细胞状态，对于感兴趣的细胞类型（WNT2+ 成纤维细胞），我们首先根据 Milo95 差异丰度测试（如上所述）识别出属于早期邻域（SpatialFDR < 0.1，log(倍数变化) < 0）和晚期邻域（SpatialFDR < 0.1，log(倍数变化) > 0）的指数细胞（补充表 4）。
2. 使用 scanpy 中的 Wilcoxon 秩和检验实现（scanpy.tl.rank_genes_groups, method = "wilcoxon"）计算了早期和晚期细胞状态之间的差异表达基因（DEGs）。
3. 差异表达 log(倍数变化) > 1 且调整后的 P 值 < 0.01 的基因被认为是显著过表达的（补充表 16），用于使用 GSEApy（https://gseapy.readthedocs.io/; v.0.10.7）进行基因集富集分析，查询数据库为 Gene Ontology Biological Process（2023）（补充表 17 和 18）。

Gene module scoring

基因模块评分

Para_01

1. 使用 scanpy 中的 sc.tl.score_genes 函数进行基因模块评分。
2. 对于血管生成基因模块，使用了从 Enrichr 库下载的 Gene Ontology Biological Process 数据库（2021）中预定义的基因集（下载自 Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/#libraries)）。
3. 对于内皮细胞模块，定义顶端、基部、动脉、小静脉和淋巴管、毛细血管的基因集（扩展数据图 10g,h）来源于已发表的文献，并且对于缺氧评分，使用了一个标志性的缺氧基因列表。
4. 每个基因模块的基因列表见补充表 27 和 29。
5. 每个模块的得分是所提供基因集的平均表达量减去参考基因集的平均表达量。
6. 参考集包括 100 个基因（ctrl_size=100），这些基因是从数据集中所有基因（默认 gene_pool）随机抽取的，抽样时使用了 25 个表达水平区间（n_bins=25）。
7. 对于血管生成模块，计算了每种感兴趣的细胞类型（例如，LYVE1+ 巨噬细胞）的平均模块得分，并进行了 z 分数标准化以用于可视化。

Gene regulatory network analysis

基因调控网络分析

Para_01

1. 使用 PySCENIC 包（版本 0.11.2）和管道来识别合并的产前皮肤和 SkO 单细胞 RNA 测序数据集中的转录因子及其靶基因。
2. 排名数据库（hg38 refseq-r80 500bp_up_and_100bp_down_tss.mc9nr.feather）和基序注释数据库（motifs-v9-nr.hgnc-m0.001-o0.0.tbl）从 Aert 实验室的 GitHub 页面下载。
3. 该工具运行了 10 次，每次使用的数据集包含每种细胞类型 × 组织对最多 1,000 个细胞（其中组织是产前皮肤或 SkO）。
4. 对于每次运行，都会生成一个转录因子及其目标的邻接矩阵，并使用 Aert 团队建议的参数进行修剪。
5. 仅在至少 6 次运行中出现的调控子用于分析。
6. 使用 PySCENIC 和 aucell 函数计算每个细胞类型 × 组织对的调控子特异性得分。
7. 多次运行的平均值被计算出来。
8. 这些平均分数用于比较产前皮肤和 SkO 之间的调控子活性。
9. 首先通过查询 STRING 数据库构建基因相互作用网络，使用 GATA2 靶基因，然后仅保留报告与 GATA2 相关的基因。
10. 列表进一步缩短到 12 个基因，保留满足以下条件的基因：（1）胎儿皮肤中检测到的五个最活跃调控子中的转录因子；和/或（2）类器官毛细血管小动脉；和/或（3）与伪时间相关（即，在轨迹中）；和/或（4）VEGF 受体；和/或（5）选择的基因本体论术语，因其在血管生成、细胞外基质组织、细胞迁移、通讯、增殖或死亡中的作用（GO:0045765, GO:0001568, GO:0030334, GO:0010646, GO:0001936, GO:0045446, GO:0002040, GO:0030155, GO:0010941 和 GO:0030198）。

Comparison of pro-angiogenic and anti-angiogenic genes between prenatal skin and SkO

产前皮肤与SkO之间促血管生成和抗血管生成基因的比较

Para_01

1. 使用 Harmony（v.0.0.5）整合了产前皮肤和 SkO 数据集，如上所述。
2. 使用标准的 scanpy 工作流程（scanpy.tl.rank_genes_groups，method = "wilcoxon"）对产前皮肤和 SkO 细胞（所有细胞类型）进行了差异表达分析。
3. 识别出的差异表达基因被过滤，仅保留编码分泌蛋白的基因。
4. 使用 Python 包 GSEApy 中实现的 Enrichr 工作流，分别对下调和上调基因进行了基因集富集分析，查询数据库为 Gene Ontology Biological Process（2021）。
5. 根据与血管的相关性筛选出显著的基因本体论术语（调整后的 P 值 < 0.05）。
6. 仅选择了涉及所选通路的差异表达基因，并在文献中检查了它们在产前皮肤血管生成中的作用。

NicheNet analysis

NicheNet分析

Para_01

1. 我们使用了 NicheNet（v.1.1.1）来推断配体-靶基因链接，通过结合相互作用细胞（发送者和接收者细胞）的单细胞 RNA 测序数据（胎儿皮肤和 SkO）与现有的信号传导和基因调控网络知识。
2. 一个包含分析中使用的所有集成数据源的开源 R 实现可在 GitHub 上获得（https://github.com/saeyslab/nichenetr）。
3. NicheNet 的配体-活性分析首先评估并排名发送细胞类型（巨噬细胞亚群）中的配体，这些配体最能预测接收细胞类型（内皮细胞）中目标基因相对于背景基因表达变化的观察结果。
4. 潜在配体被定义为 NicheNet 模型中至少在每个巨噬细胞（发送者）簇的 10% 细胞中表达的所有配体，并且至少有一个特定受体在至少 10% 的内皮细胞（接收者）中表达。
5. 目标基因是通过 NicheNet 中的 FindMarkers 函数在接收细胞条件下（胎儿皮肤与 SkO）之间鉴定的差异表达基因（调整后的 P 值 ≤ 0.05 和平均 log2(倍数变化) > 0.25，在至少 10% 的内皮细胞中表达）。
6. 背景基因是在 NicheNet 模型中至少在 10% 的接收细胞中表达的所有基因。

Para_02

1. 配体根据配体活性得分进行优先排序，该得分计算为配体的目标预测与观察到的目标基因表达之间的皮尔逊相关系数（补充表35）。
2. 排名前20的配体用于预测活跃的目标基因（总体排名前200位）并构建活跃的配体-目标链接（补充表36）。
3. 顶级配体的受体从NicheNet模型中识别出来，该模型仅筛选文献和公共数据库中记录的真实配体-受体相互作用（补充表37）。
4. 为了推断信号路径，我们定义了感兴趣的配体（VEGFA，用红色表示）和目标基因（GATA2，用蓝色表示）。
5. NicheNet确定哪些转录因子最能调节目标基因，并且最接近配体，基于其整合的配体信号传导和基因调控网络中的边权重。
6. 选择这些转录因子与定义的配体之间的最短路径，这些路径上的基因被认为是相关的信号介质（用灰色表示）。
7. 通过在NicheNet的不同整合数据源中交叉检查定义的配体、目标基因和已识别的转录因子及信号介质之间的相互作用，对信号介质进行优先排序。

Spatial data analysis

空间数据分析

Para_01

1. 空间转录组数据使用 Space Ranger (v.2.0.1) 和 GRCh38-1.2.0 参考进行映射。
2. 同时，我们手动选择了胚胎肢体数据中与皮肤重叠的点，包括以下年龄的样本：6 周胎龄（n = 2，重复 = 2 次）和 8 周胎龄（n = 1，重复 = 3 次）。
3. 为了将通过单细胞 RNA 测序鉴定的细胞类型映射到已分析的空间转录组切片上，我们使用了 Cell2location (v.0.1) 方法。
4. 首先，我们训练了一个负二项回归模型，以估计器官中通过单细胞 RNA 测序分析的所有细胞类型的参考转录组谱型（n = 15 个样本）。
5. 我们排除了表达量极低的基因，使用了 Cell2location 作者推荐的过滤策略（cell_count_cutoff=5, cell_percentage_cutoff2=0.03, nonz_mean_cutoff=1.12）。
6. 对于样本中≤10 周胎龄且识别出少于 20 个细胞的细胞类型，从参考中排除。
7. 单个 10x 样本被视为一批，供体和化学类型信息作为分类协变量包含在内。
8. 训练进行了 250 个周期，并根据手动检查达到了收敛。
9. 接下来，我们使用不同细胞类型的参考转录组谱型估计了空间转录组切片中细胞类型的丰度。
10. 所有切片联合分析。
11. 使用了以下 Cell2location 超参数：(1) 预期细胞丰度 (N_cells_per_location) = 30；(2) 检测效率效应的正则化强度 (detection_alpha) = 20。
12. 训练在 50,000 次迭代后停止。
13. 所有其他参数均使用默认设置。
14. Cell2location 估计每个点每种细胞类型的细胞丰度的后验分布。
15. 后验分布总结为 5% 分位数，代表模型高置信度的细胞丰度值，因此将估计中的不确定性纳入论文报告的值以及用于下游共定位分析的值中。

Para_02

1. 为了识别共定位细胞类型的微环境，我们使用了非负矩阵分解（NMF）。
2. 我们首先通过将估计的细胞类型丰度矩阵除以每个点的总丰度来对其进行归一化。
3. 得到的矩阵 Xn 的维度为 n × c，其中 n 是 Visium 幻灯片中的总点数，c 是参考中的细胞类型数量，该矩阵被分解为 Xn = WZ，其中 W 是一个 n × d 的潜在因子值矩阵，Z 是一个 d × c 的矩阵，表示每个细胞类型归因于每个潜在因子的丰度比例。
4. 这里的潜在因子对应由一组共定位细胞类型定义的组织微环境。
5. 我们使用 R 语言的 NMF 包，设置因子数 d = 10，并使用默认算法。
6. NMF 系数通过每个因子的最大值进行归一化。
7. 我们运行了 100 次 NMF 并构建了重合矩阵。
8. 然后，我们根据在重合矩阵上计算的较低平均轮廓系数选择了最佳运行。
9. 如果有多次运行的平均轮廓系数最小，则选择偏差较小的一次（如 NMF 函数报告所示）。

Para_03

1. 为了进行细胞类型丰度相关性分析，我们使用了每个点归一化的 Xn 矩阵。
2. 计算了每对细胞类型（计算所有可能的配对）和每个样本的皮尔逊相关系数。
3. 为了可视化相关性分析，选择了由 NMF 结果指导的细胞对进行绘制，这些细胞组或类别形成了微环境。
4. 例如，在图 1d 中，巨噬细胞与内皮细胞（ME1 和 ME5）、神经细胞（ME1 和 ME5）以及成纤维细胞（ME1、ME4 和 ME5）形成了微环境（补充表 40）。

Reporting summary

报告摘要

Para_01

1. 有关研究设计的更多信息，请参阅与本文链接的《自然组合报告摘要》。

Data availability

Para_01

1. 当前研究中生成和/或分析的数据集可在以下存储库中获得。
2. 产前单细胞 RNA 测序皮肤数据可从 ArrayExpress 获得，登录号为 E-MTAB-11343、E-MTAB-7407 和 E-MTAB-13071；伴随的产前皮肤 TCR 测序数据可在登录号 E-MTAB-13065 下获取。
3. SkO 单细胞 RNA 测序数据可从基因表达综合数据库（GEO）获得，登录号为 GSE147206、GSE188936 和 GSE231607。
4. Visium 肢体数据可在 E-MTAB-10367 下获得。
5. Visium 面部和腹部数据已存放在 ArrayExpress，登录号为 E-MTAB-13024。
6. 胚胎巨噬细胞单细胞 RNA 测序数据可从 GEO 获得，登录号为 GSE13345 和 GSE137010。
7. 作为本研究一部分分析的所有血管类器官单细胞 RNA 测序数据均包含在一篇预印本文章中。
8. 成人健康皮肤单细胞 RNA 测序数据可从 ArrayExpress 获得，登录号为 E-MTAB-8142。
9. 成人毛囊单细胞 RNA 测序数据可从 GEO 获取，登录号为 GSE129611。
10. 小鼠和驯鹿皮肤单细胞 RNA 测序数据分别可从 E-MTAB-11920 和 GSE168748 获得。
11. 处理后的数据可在我们的网络门户上访问（https://developmental.cellatlas.io/fetal-skin）。
12. 本研究使用到的资源数据库包括 GRCh38 参考、Ensembl Biomart、2021 年和 2023 年的基因本体生物过程、2020 年的 MSigDB 标志、排名（hg38 refseq-r80 500bp_up_and_100bp_down_tss.mc9nr.feather）和用于 PySCENIC 分析的基序注释数据库（motifs-v9-nr.hgnc-m0.001-o0.0.tbl），以及 STRING（v12.0）。
13. 源数据随本文一并提供。

Code availability

Para_01

1. 单细胞和空间数据使用公开可用的软件包进行处理和分析。
2. 用于重现这些分析的 Python、R 代码和笔记本在 Zenodo 上公开获取（https://doi.org/10.5281/zenodo.8164271）。