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全基因组 - 人类基因组变异分析（PacBio) （2）-- CCS的使用

原创

三代测序说

修改于 2023-10-26 06:47:21

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一、基因组 PacBio SMRTbell文库的构建流程

1. PacBio SMRTbell 文库的结构

PacBio测序平台构建完成的测序文库形状就如同一个哑铃(Dumbell), 所以叫做SMRT bell, 图1右所示。其主要组成部分是：发卡状的接头（Hairpin Adapter）和双链DNA模板（Double Stranded DNA Template）。而文构建完成后、测序前还需要完成SMRT bell文库、Sequencing Primer、DNA Polymerase的混合工作（测序引物退火结合环装测序接头，然后引物-bell文库复合物结合DNA聚合酶, 图1右和图2所示。

2. 基因组SMRTbell文库构建流程

以基因组HiFi文库为例（10-20Kb文库 ) ，图1左所示：

1）通过核酸提取得到基因组DNA（gDNA)后，先利用G-tube管或Megaruptor System将基因组片段化至合适大小（一般动植物基因组20 Kb建库，微生物基因组10 Kb建库）；

2）通过去除单链悬突、损伤修复和末端修复等步骤，得到完整的双链DNA插入片段；

3）通过将SMRTbell接头连接至双链DNA的两端来创构建SMRTbell测序文库，从而得到环状模板。

4）完成接头连接后，需要对连接产物进行纯化，利用酶处理来消化线性或内部损伤环形DNA分子（游离的Hairpin Adapter、两端未连接Adapter的DNA模板、已成环但内部有损伤的DNA模板），酶处理完毕后，一般会利用Bulepippin或Sage ELF System切胶回收目标大小范围内的文库。

二、PacBio Subreads and HiFi reads

HiFi reads（High Fidelity reads）是2019年由PacBio推出的基于环化共有序列（Circular Consensus Sequencing，CCS）模式产生的既兼顾长读长（~10-20 kb）又具有高精度（>99%准确率）的测序序列数据（图3）。

对于一条待测序的DNA片段，在CCS测序模式下，酶读长（polymoerase read）远大于插入片段长度，聚合酶会绕着DNA模板进行滚环测序，其中插入目的片段会被多次重复测序。单次测序中产生的随机测序错误，通过环形测序生成的一系列冗余的Subreads来进行自我矫正。通过PacBio公司开发的CCS算法进行自我纠错校正后，最终得到一条高准确度的CCS read, 因为每个碱基的测序质量较高，所以称为HiFi read （图4）。

三、PacBio Subreads 数据到 HiFi reads数据

Pacbio Sequel II 平台早期支持CLR（Continuous Long Reads）和CCS（Circular Consensus Sequencing）两种测序方式。 CLR模式适用超长片段文库（> 25 kb），对下机的subreads数据不再进行后续处理，可以直接使用，用作下游分析的原始数据，唯一的缺点就是每条reads准确度低一些。

从2022年下半年起，最新的建库试剂盒SMRTbell prep kit 3.0 舍弃了CLR模式，全部采用CCS建库测序模式，所以下机的subreads都要经过CCS算法将subreads去冗余转化为HiFi reads。对于Pacbio Sequel II 平台的用户，下机的subreads数据需要在服务器用SMRTlink软件里的CCS程序或者自己运行单独安装CCS软件进行HiFi reads的转换。对于Pacbio Sequel IIe 和 Revio平台，因为测序仪器本身内置了计算服务器，可以在运行测序前通过SMRTlink设置，下机直接得到HiFi reads的数据。

所以在大家拿到PacBio测序数据时，例如下载公共数据尤其是早期数据时，一定要弄清楚是subreads，还是HiFi reads。对于近期从测序服务商那里得到的数据一般都是运行完CCS软件后的HiFi reads。

对于自己有PacBio仪器的，并且服务器配置SMRTlink软件的用户，可以直接在SMRTlink中运行CCS（Circular Consensus Sequencing）程序，运行完成以后，你还会在SMRTlink里面得到CCS分析报告，会给出HiFi reads的信息以及可视化图的统计信息展示。

下面的教程呢，是我们没有测序仪器和安装配置SMRTlink软件，但又想单独在自己的服务器或者高性能工作站上安装CCS程序并且运行的同学和老师准备的。

四、CCS程序的安装和使用

CCS官网：https://ccs.how/

CCS官网(github)：https://github.com/PacificBiosciences/ccs

1. 确保已经安装miniconda

#直接使用conda安装最新版本的pbccs
$ conda install -c bioconda pbccs

#Version 6.4.0

2. 软件的运行

Pacbio Sequel II平台的下机数据为bam格式， bam文件可直接适配大多数的下游分析软件，存储有效数据的文件一般命名为： *.subreads.bam, *.subreads.bam.pbi。

输入文件：sample.subreads.bam 以及相对应的索引sample.subreads.bam.pbi

输出文件：unaligned BAM (.bam);bgzipped FASTQ (.fastq.gz)。

基础使用，全部参数默认：

#生成 .bam 文件
$ ccs  sample.subreads.bam  sample.ccs.bam

#生成 .fastq.gz 文件
$ ccs  sample.subreads.bam  sample.hifi.fastq.gz

进阶使用

#生成.bam文件
$ ccs  --min-rq  0.99 --min-passes 3 -j 12  sample.subreads.bam  sample.ccs.bam

#生成 .fastq.gz 文件
$ ccs  --min-rq  0.999 --min-passes 5  -j 24  sample.subreads.bam  sample.hifi.fastq.gz

#以下是经常会设置参数，根据数据和应用的需求自行调整，剩下的参数默认即可。
-j  12    CPU线程数
--min-passes 3     最少产生CCS read 的subreads数，默认是3.
--min-rq  0.99       碱基准确度，默认为0.99，等于Q20.
--min-length         最小reads长度，默认为10.
--max-length        最大reads长度，默认为50000.

CCS --help 文档及参数，如果有需要可以自行修改：

ccs - Generate circular consensus sequences (ccs) from subreads.

Usage:
  ccs [options] <IN.subreads.bam|xml> <OUT.ccs.bam|fastq.gz|xml>

  IN.subreads.bam|xml       FILE   Subreads (.subreads.bam or .subreadset.xml).
  OUT.ccs.bam|fastq.gz|xml  FILE   Consensus reads (.bam, .fastq.gz, or .consensusreadset.xml).


Input Filter Options:
  --min-passes              INT    Minimum number of full-length subreads required to generate CCS for a ZMW. [3]
  --min-snr                 FLOAT  Minimum SNR of subreads to use for generating CCS [2.5]
  --top-passes              INT    Pick at maximum the top N passes for each ZMW. [60]

Draft Filter Options:
  --min-length              INT    Minimum draft length before polishing. [10]
  --max-length              INT    Maximum draft length before polishing. [50000]

Chunking Options:
  --chunk                   STR    Operate on a single chunk. Format i/N, where i in [1,N]. Examples: 3/24 or 9/9
  --max-chunks                     Determine maximum number of chunks.

Model Override Options:
  --model-path              STR    Path to a chemistry model file or directory containing model files.
  --model-spec              STR    Name of chemistry or model to use, overriding default selection.

Processing Options:
  --by-strand                      Generate a consensus for each strand.
  --hd-finder                      Enable heteroduplex finder and splitting
  --skip-polish                    Only output the initial draft template (faster, less accurate).
  --all                            Emit all ZMWs.
  --subread-fallback               Emit a representative subread, instead of the draft consensus, if polishing failed.
  --all-kinetics                   Calculate mean pulse widths (PW) and interpulse durations (IPD) for every ZMW.
  --hifi-kinetics                  Calculate mean pulse widths (PW) and interpulse durations (IPD) for every HiFi read.

Output Filter Options:
  --min-rq                  FLOAT  Minimum predicted accuracy in [0, 1]. [0.99]

Output Files Options:
  --report-file             FILE   Where to write the results report.
  --report-json             FILE   Where to write the results report as json.
  --metrics-json            FILE   Where to write the zmw metrics as json.
  --suppress-reports               Do not generate report or metric files per default, only those requested.

  -h,--help                        Show this help and exit.
  --version                        Show application version and exit.
  -j,--num-threads          INT    Number of threads to use, 0 means autodetection. [0]
  --log-level               STR    Set log level. Valid choices: (TRACE, DEBUG, INFO, WARN, FATAL). [WARN]
  --log-file                FILE   Log to a file, instead of stderr.

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