【线上】升级！单细胞测序全流程分析课程

拒绝平凡，勇“单”重任

科学技术的进步促进了我们世界奥秘更为深入的理解。在生命科学研究领域，过去20年中对现代生物学和医学研究产生巨大影响的技术莫过于二代测序技术的逐渐成熟、推广和相关下游技术的开发。二代测序技术打开了从基因组水平去开展疾病诊断、基因鉴定和功能研究的大门。

伴随着二代测序技术成本的降低和测序通量的增加，传统的分子生物学研究手段例如基因芯片、CGH、多重PCR测序、CpG岛的寡核苷酸芯片检测技术等等逐渐被RNA-seq、外显子组和全基因组以及CpG位点高通量测序等技术代替。

近几年，在二代测序技术应用最受关注的领域莫过于单细胞测序技术的发展和应用。相对于传统一代和普通的RNA-seq、WES和WGS二代测序技术，单细胞测序通过对单个细胞的基因表达（例如scRNA-seq和SMART-seq）、空间转录组测序、基因组测序（scDNA-seq）测序、甲基化组测序（single-cell DNA methylome）和单细胞的染色质转座酶可及性（scATAC-seq）的高通量测序使得我们对生命机理的认识达到史无前例的单细胞水平。

科学家们可以通过对单细胞的多方面生物特征开展多层次（基因序列、转录、表观修饰等）的研究，同时通过对细胞间通讯、空间位置的分析进一步加深了我们对细胞间异质性、组织微生态特征的认识，这深化我们对致病机理理解，并进一步促进潜在药物靶点研发和临床诊断标志物的发展。

热点所向，大势所趋

基于单细胞技术的研究近年呈指数级增长，我们以“Single-Cell RNA Sequencing”为关键词检索PubMed可以发现，截止2022年3月初已发表研究论文8752篇，2022年1月至3月初就发表相关论文838余篇，已超过2018年全年发表论文总量。

可以预见的是，伴随着测序成本的降低和单细胞测序技术技术垄断壁垒的攻克，单细胞测序技术的成本将极有可能现在的2-3万/样本（8000个细胞左右/样本），降低到0.2-0.3万/样本甚至更低，并进入每个实验室和研究组，就如同基因芯片技术、Western Blot甚至PCR技术一样成为日常科学研究的基本手段和方法。

然而，与传统技术不同的是，单细胞测序技术所产生的数据量往往远超传统的基因芯片和RNA-seq数据，这就为单细胞数据的处理和分析带来了极大的挑战和机遇。不难想象，今后科研课题组、研究中心中将产生对相关专业人才的极大需求，单细胞分析数据的结果为设计开展新的研究内容和方向提供指引，也将成为科研人员的基本技能。

庖丁解牛，通路解析

那么目前常规的scRNA-seq分析主要由哪些？我们通过比较多篇发表的研究论文，不难发现其中的奥秘和窍门。比如，我们分析了多篇在肿瘤学研究中的研究论文，例如《Single-cell transcriptomic analysis defines the interplay between tumor cells, viral infection, and the microenvironment in nasopharyngeal carcinoma》（发表在Cell Res. 2020 Nov;30(11):950-965.）、《Tumor and immune reprogramming during immunotherapy in advanced renal cell carcinoma》（发表在Cancer Cell. 2021 May 10;39(5):649-661.e5）以及《Decoding the multicellular ecosystem of lung adenocarcinoma manifested as pulmonary subsolid nodules by single-cell RNA sequencing》（发表在Sci Adv. 2021 Jan 27;7(5):eabd9738）等等，发现单细胞研究基础和核心的分析内容主要包括以下几个主要部分：

1. 数据获取和清理
2. 质量控制和筛选
3. 多样本、多批次的数据整合分析
4. 细胞亚群的鉴定、注释和功能注释
5. 肿瘤细胞和正常细胞的鉴定和拷贝分析
6. 拟时序分析分析
7. 细胞转录活性调控分析
8. 细胞间通讯分析
9. 基于RNA-seq或者公共数据（TCGA和GEO）的临床意义挖掘分析

如果你对免疫细胞scTCR-seq和scBCR-seq感兴趣的话，我们的课程还会附带带领你对免疫细胞克隆开展初步分析！

我们以Sci Adv. 2021 Jan 27;7(5):eabd9738.论文为例简单解析单细胞scRNA-seq分析的主要内容：

论文主要图表1: A.文章总体设计，包括作者团队自己获取的数据以及部分公共数据的获取和整合；B. 整体单细胞分组UMAP图；C. 特征性marker的表达水平；D.免疫细胞的占比图。

论文主要图表2: D.上皮细胞的拷贝数变异情况；F. 分组细胞的差异基因功能富集分析；G. GSVA分析结果的热图对比。

论文主要图表3: A和B.免疫细胞的整合；C. 代表性marker的表达热图；D. T细胞特征性marker基因的平均表达水平；E. T细胞特征性功能的累积分布图。F，G不同细胞亚群在组织类型中的分布和差异分析；H. TCGA-LUAD的CD8T细胞浸润水平和患者生存预后之间的相关性；I. 采用Diffusion Map对细胞的分化轨迹进行分析；J. T细胞的杀伤/耗竭状态比重在不同组细胞之间的差异分析。

论文主要图表4: A主要细胞亚群之间的细胞交互作用；B，C关键Ligand-receptor分子在不同细胞中的表达水平；D，细胞之间的关键交互作用信号通路分子表达情况。

授人以鱼不如授人以渔

然而，目前没有哪个软件能靠简单的点点鼠标就能完成高质量的单细胞数据分析，甚至很多课题组在将单细胞外包给一些单细胞测序服务商后，拿到的数据不符合预期甚至完全无法使用和发表。

因此，为了广大研究生，包括科研小白和代码小白能顺利开展承担单细胞测序数据的分析能力，我们精心设计了一套基于R语言的完整版单细胞RNA测序分析课程，从R语言入门循序渐进到实际开展单细胞数据分析，满满干货！让你尽快熟悉完成上述9大数据分析的能力，从而课题组里单细胞数据分析的任务，成为别人眼中的“科研达人”！