成脂谱系前体细胞通过瞬时扩增和肌成纤维细胞转化介导骨髓放射修复

本文利用单细胞测序发现的新的细胞亚群骨髓脂系前体细胞，通过一系列的实验验证其在骨髓放射损伤修复中的作用。

本文发表于：

• Transient expansion and myofibroblast conversion of adipogenic lineage precursors mediate bone marrow repair after radiation. JCI Insight. 2022 Apr 8; 7(7): e150323.
• Published online 2022 Apr 8.
• doi: 10.1172/jci.insight.150323

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研究思路如下：

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摘要

放射会导致骨髓细胞的崩溃和微血管的消失。为了了解骨髓在放射后如何恢复，我们重点研究了骨髓间充质细胞，这些细胞为骨髓造血和血管生成提供了支持性微环境。我们最近发现了骨髓成脂谱系前体细胞(MALPs)的非增殖亚群，其表达成脂标记物而无脂质积累。 单细胞转录组分析显示，MALPs在放射后不久获得增殖和肌成纤维细胞特征。使用脂肪细胞特异性Adipoq-Cre，我们验证了MALPs在放射后第3天快速短暂扩增，与骨髓血管扩张和骨髓细胞减少相一致。同时，MALPs失去了大部分的细胞突起，变得更长，并高度表达肌成纤维细胞相关基因。放射激活MALPs中的mTOR信号，这对于它们的肌成纤维细胞转化和随后第14天的骨髓恢复是必需的。MALPs的消融阻断了骨髓脉管系统和细胞结构的恢复，包括造血干细胞和祖细胞。此外，MALPs中的VEGFa缺乏延迟了放射后的骨髓恢复。 总之，我们的研究证明了MALPs在介导放射损伤后骨髓修复中的关键作用，并揭示了治疗放疗后骨髓抑制的细胞靶点。

研究结果

1.辐射快速扩增骨髓间充质细胞

辐射会对骨髓细胞和脉管系统造成急性损伤。这种损害即使不严重，也常常会在以后恢复。我们和其他研究表明，Col2a1-Cre标记了骨中所有的间充质谱系细胞。为了随着时间的推移监测这些细胞，我们在第0天对1个月大的Col2a1-Cre番茄(Col2/Td)小鼠的右股骨施加了5 Gy的聚焦辐射，并发现骨髓CD45+造血细胞和骨髓细胞结构在3天后分别急剧减少了84%和85%(图1，A–C)。从第7天开始，骨髓细胞大部分恢复，反映了辐射后骨髓的修复能力。主要由毛细血管组成的脉管系统普遍分布在骨髓中。辐射损伤了骨髓内皮细胞，显著改变了骨髓脉管系统，导致第3天血管扩张和血管密度降低(图1，D和E)。与骨髓细胞相似，血管损伤在第7-14天基本修复。

令我们惊讶的是，在辐射后的第3天，我们观察到Col2/Td小鼠的骨髓Td+细胞显著增加，然后在第7-14天恢复正常(图1F)。

流式细胞术证实了Td+细胞的这种短暂扩增(图1G)。有趣的是，间充质谱系细胞扩增和消失的时间过程分别与骨髓损伤和修复的时间过程密切相关，这促使我们进一步研究它们的关系。

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2.ScRNA-Seq分析预测MALPs的细胞周期进入和肌成纤维细胞转化

放射后处理的Col2/Td小鼠股骨Td+细胞进行scRNA-Seq分析，获得了2401个细胞，每个细胞平均有18801个独特的分子标识符，每个细胞平均有3772个基因(补充图1A)。其中间充质细胞2294个，造血细胞19个，内皮细胞11个，周细胞77个(补充图1B)。

• EMP：早期间充质祖细胞
• LMP：晚期间充质祖细胞
• LCP：谱系定向祖细胞
• OB：成骨细胞
• Ocy：骨细胞
• MALP：骨髓成脂谱系前体
• CH：软骨细胞
• Mural cell：周细胞
• EC：内皮细胞
• Myeloid cell：髓系细胞

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图2A：非软骨间充质细胞的umap图

图2B：根据亚群特异性标记的基因，来自未放射和放射小鼠的间充质亚群包括EMPs、LMPs、LCPs、成骨细胞、骨细胞和MALPs

图2C：放射小鼠单细胞数据集的拟时分析显示，EMPs、骨细胞和MALPs位于轨迹的3个末端，表明它们是所有细胞的起源或终末分化细胞

• EMPs表达Ly6a (Sca1)、Cd34和Thy1等几种常见的干细胞标记
• LMPs不具有特异性干性基因，但高表达Aspn、Edil3、Tnn、Postn基因
• LCPs高表达Limch1和Kcnk2
• 成骨细胞和骨细胞表达成骨标记
• MALPs表达成脂标记基因的水平比所有其他亚群高

图2D：放射前后单细胞数据整合图。图2E：放射后，EMP和LMP急剧缩小，而LCP和MALPs则扩大

图2F：细胞周期分析显示，EMPs、LMPs、LCPs和MALPs中增殖细胞的百分比在辐射数据集中均有所增加

图2G：整合数据集的拟时分析显示与正常条件下相比放射促进分化()。

图2H：MALPs在辐射后更倾向于向成脂分支的末端移动。

本研究研究中，MALPs在未受辐射的小鼠中不增殖，辐射后MALPs的进入细胞周期循环开始增殖。

对EMPs、LMPs、LCPs和MALPs中DEGs的GO和KEGG分析

图3A：细胞外结构组织、伤口愈合、上皮细胞增殖和平滑肌细胞增殖，在放射后发生了改变。

图3B：促进肌成纤维细胞转化的相关的基因在放射后的LCPs和MALPs中增加。

图3C：肌成纤维细胞是伤口愈合过程中的ECM胶原蛋白基因的表达显著升高 。

图3D 和3E：GSEA分析显示，放射后MALPs中促进肌成纤维细胞形成的mTOR信号通路富集及其基因表达升高。

scRNA-Seq分析预测间充质谱系细胞，特别是LCPs和MALPs，在放射后获得成肌纤维细胞表型。

3.放射通过刺激MALP快速增殖促进其细胞池的扩增

之前研究表明Adipoq脂联素也可以标记MALPs细胞。为了证明单细胞数据预测的ScRNA-Seq分析预测放射后MALPs的细胞周期进入和肌成纤维细胞转化。作者采用Adipoq-Cre番茄(Adipoq/Td)小鼠的右股骨进行局部放射。与Col2/Td小鼠类似，Adipoq/Td小鼠在放射后第3天显示Td+细胞显著增加，然后在稍后的时间点逐渐下降(图4，A和B)。流式结果也显示相同的结果(图4C)。表明MALPs变成了LiLAs。

在Adipoq/Td和AdipoqER/Td小鼠中，MALPs、LiLAs和总成脂谱系细胞(MALPs加LiLAs)分别在放射后第3、7和3天达到峰值(图4B)。

MALPs以骨髓基质细胞和毛细血管周细胞的形式存在。为了确定MALPs的增殖状态，对1个月大的Adipoq/Td小鼠进行局部放射和EdU注射。未放射组，Td+细胞，都没有任何EdU掺入(图4，D和E)。

相反，在放射后，虽然骨髓内的EdU信号大大减弱，但相当一部分Td+基质细胞(9.9%)和周细胞(6.7%)变成了EdU+，表明放射刺激了它们的增殖。

此外，来自Adipoq/Td小鼠的分选Td+细胞的定量实时PCR (qRT-PCR)分析证实，细胞周期促进基因在放射后上调(图4F)。γH2AX和TUNEL染色分别显示，放射确实诱导了DNA DSBs，但没有诱导MALPs的凋亡(图4G)。

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集落形成单位成纤维细胞(CFU-F)试验检测增殖的间充质谱系细胞。在正常情况下，来自1个月大的Adipoq/Td小鼠的骨髓细胞仅形成Td–CFU-F集落，这表明MALPs不增殖。引人注目的是，虽然放射显著降低了总数量和Td–CFU-F数量，但它促进了Td+ CFU-F菌落的形成(图4，H和I)。来自受放射小鼠的Td+细胞，而不是来自正常小鼠的Td+细胞，甚至在生长培养基中也出现了自发的脂肪生成(图4J)。当在成脂分化培养基中培养5天时，来自放射小鼠的骨髓间充质细胞比来自非放射小鼠的细胞包含更多的脂滴(图4J)和表达更多的成脂标记物(图4K)。综上所述，上述分析证实了MALPs(非增殖细胞)在放射后快速获得增殖能力。

4.放射将MALPs转化为肌成纤维细胞

作者接下来分析了MALPs放射后的肌纤维细胞特征。来自Adipoq/Td小鼠的分选骨髓Td+细胞的qRT-PCR证实，肌成纤维细胞标记物，如Acta2、Tagln和Myl9，以及ECM蛋白，如Col1a1、Col91a1和Col11a2，在放射后第3天都增加了(图5A)。

免疫染色进一步证实了α–平滑肌肌动蛋白(α-SMA；Acta2)、Tagln、Myl9和I型胶原在放射后的骨髓蛋白水平上显著增加(图5B)。

作者之前的研究表明，MALPs具有独特的形状，包含中央细胞体和多个细胞突起，形成贯穿骨髓的3D网络结构。放射极大地减少了细胞突起和圆形，导致第3天出现成肌纤维细胞的形状(图5，C–E)。这些形状变化随着时间逐渐恢复。

共聚焦3D成像显示：骨髓毛细血管被从Td+周细胞和Td+基质细胞延伸的细胞突起包裹。与MALPs细胞突起的总体减少相一致，放射后不久包裹血管的细胞突起也大大减少(图5，F和G)。

有趣的是，这伴随着覆盖血管的Td+周细胞减少78%(图5，H和I)和Td+周细胞中脂质的积累(图5J)。

在健康小鼠中，没有观察到周细胞具有脂质。放射似乎快速加速了Td+ MALPs向LiLAs的分化，这与GO term分析发现放射上调MALPs中与脂肪细胞分化、脂肪酸代谢过程、脂滴和脂肪酸氧化相关的途径一致。注意LiLAs没有细胞突起(图5K)。因此，细胞突起的缺失可能导致周细胞从血管中脱离，解释了放射增加总MALPs但减少MALPs的周细胞部分的矛盾。

5.MALPs对于放射后的骨髓修复是必不可少的

为了研究MALPs在放射后恢复骨髓腔室中的作用，作者将白喉毒素(DT)注射到1个月大的Adipoq/Td/DTR小鼠中14天，有效地消除了Td+细胞，包括有或无放射的骨髓中的MALPs和Perilipin+ LiLAs(图6A)。

放射后注射脂质体的小鼠的骨髓细胞大部分恢复，但在注射DT的小鼠中，骨髓细胞仍处于非常低的水平。具体而言，与赋形剂组相比，DT组中的CD45+造血细胞(图6B)和总骨髓细胞(图6C)分别减少了81%和85%。然而，在放射条件下，骨髓细胞减少更为严重。

造血细胞的分析显示，在放射后第14天，只有B细胞，而不是T细胞、骨髓细胞或HSPCs得到了恢复(图6，D和E)。DT注射进一步显著减少了骨中这些细胞的数量，表明MALPs对放射后造血恢复至关重要。

除了造血细胞，骨髓是高度血管化的。尽管在注射赋形剂的小鼠中，骨中的血管在放射后第14天大部分恢复，但在注射DT的小鼠中，它们仍然受损(图6F)。具体来说，血管直径和面积分别增加了2.6倍和10.9倍，而血管密度下降了51%(图6G)。同时，正如预期的那样，在注射DT的小鼠中，Td+周细胞保持在非常低的水平(图6H)，并且内皮细胞的数量也显著减少(图6I)。

这些数据表明，MALPs对于骨髓中的血管再生是至关重要的。与这些观察结果一致，我们的scRNA-Seq数据集指出，在正常和放射骨中，MALPs表达许多血管生成因子的水平比其他间充质亚群高得多(补充图14)，这通过定量PCR得到了进一步验证(图6J)。综上所述，我们的数据表明，放射后MALPs的快速扩增在骨髓造血的恢复和放射损伤后骨髓脉管系统的重新稳定中起着重要作用。

我们的数据表明mTOR途径介导MALPs的肌成纤维细胞转化。为了研究这种细胞变化是否有助于骨髓恢复，我们在放射后用雷帕霉素治疗小鼠14天。这些结果表明，MALPs的肌成纤维细胞转化是修复骨髓所必需的，但不涉及放射诱导的骨髓肥胖

6.MALP衍生的VEGFa部分介导骨髓恢复

在MALPs中高表达的所有分泌因子中，VEGFa参与了造血和血管生成。为了研究其在骨髓恢复中的作用，我们构建了Adipoq-Cre Td Vegfafl/fl(Vegfa-CKO)小鼠。小鼠2个月的时候Vegfa-CKO小鼠具有与WT小鼠相同数量的malp(图7A)，但是它们的骨髓Vegfa表达减少了43%(图7B)，表明MALP是骨中Vegfa的主要来源。两周的DT注射消除了MALPs并将骨髓VEGFa水平降低了45%(图7C)。

在没有放射的情况下，Vegfa-CKO小鼠的骨髓细胞和脉管系统正常(图7，D–F)，但有趣的是，放射后这些小鼠的骨髓恢复明显延迟。具体来说，CKO的CD45+骨髓细胞明显低于野生型(图7，D和E)，CKO的血管比野生型扩张更多，数量减少更多(图7，D和F)。放射后第14天，野生型和CKO小鼠的骨髓也出现了类似的恢复(图7，D-F)。这些数据表明，VEGFa部分介导了放射损伤后MALPs的修复能力。

7.老化促进MALPs扩增，但未将其转化成肌成纤维细胞

放射和衰老是骨骼中的两种病理事件，它们具有一些共同的特征，如活性氧水平升高、DNA损伤、衰老和骨髓肥胖。为了了解MALPs在衰老过程中是否经历类似的变化，我们分析了12个月大的Adipoq/Td小鼠骨髓中的Td+细胞。与1个月大的小鼠相比，荧光成像显示Td+细胞增加了22%(图8，A和B)。令人惊讶的是，它们的细胞形状和突起数量与年轻小鼠的相同(图8，C–E)，这表明它们在衰老过程中没有经历肌成纤维细胞转化。

我们之前对1、3和16个月大的骨髓间充质谱系小鼠进行了scRNA-Seq分析。对这些数据集的分析也没有显示肌成纤维细胞相关基因在衰老过程中的表达有任何增加(图8F)。

老化对骨髓脉管系统的影响也不同于放射。老化骨髓中的血管不再扩张，而是变窄，导致血管直径、密度和面积减小(图8，G–I)。有趣的是，这种现象伴随着Td+周细胞的增加(图8J)，与总Td+细胞的增加一致。连同放射数据，我们的研究表明MALPs和骨髓血管直径之间存在负相关。

讨论与总结

1、研究证明骨髓脂肪祖细胞亚群MALPs，在放射后骨髓造血成分和脉管系统的恢复中起着重要作用。2、局部照射将MALPs从非增殖细胞转化为增殖细胞，启动器参与放射损伤修复。3、MALPs是骨髓肌成纤维细胞的主要来源，靶向MALPs可以导致不同类型骨髓纤维化的新疗法。4、scRNA-Seq数据MALPs表达高水平的微环境调节因子VEGFa介导了MALPs在放射后的修复作用。

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点评

scRNA-seq发现新的细胞亚群，表达大多数成脂标记基因，不会发生脂质积累。Vegfa部分介导了骨髓放射的恢复。不足机制做的不深，可能还存在其他的MALPs分泌的因子参与骨髓放射后的修复