质谱流式联合单细胞免疫分析鉴定胶质母细胞瘤的组合治疗靶点

文章信息

题目：Immune profiling of human tumors identifies CD73 as a combinatorial target in glioblastoma 时间：2019年12月 期刊：Nature Medicine (IF: 53.44) DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-019-0694-x

总览

CTLA-4 和PD-1/PD-L1 的免疫检查点疗法已经彻底改变了许多实体瘤的治疗。然而，免疫检查点疗法的临床疗效仅限于具有特定肿瘤类型. 多项联合免疫检查点策略的临床试验正在进行中；然而，免疫检查点的肿瘤特异性靶向的机制原理是难以捉摸的。为了深入了解肿瘤特异性免疫调节靶点，我们分析了代表五种不同癌症类型的 94 名患者，包括对免疫检查点治疗反应相对较好的患者和对多形性胶质母细胞瘤、前列腺癌和结肠直肠癌反应不佳的患者。通过质谱流式细胞仪和单细胞 RNA 测序，我们确定了一个独特的 CD73 hi多形性胶质母细胞瘤中的巨噬细胞在抗 PD-1 治疗后持续存在。为了测试靶向CD73对于多形性胶质母细胞瘤的成功组合策略是否重要，我们使用CD73 -/-小鼠进行了研究。发现，在用抗 CTLA-4 和抗 PD-1 治疗的多形性胶质母细胞瘤小鼠模型中，CD73 的缺失提高了存活率。我们的数据将 CD73 确定为一种特异性免疫治疗靶点，可改善多形性胶质母细胞瘤对免疫检查点治疗的抗肿瘤免疫反应，并证明全面的人体和反向转化研究可用于合理设计组合免疫检查点策略。

单细胞测序技术

scRNA-seq(10x Genomics) ,质谱流式技术

部分分析结果

独立研究了最近提供的来自单个肿瘤，即肾细胞癌 (RCC)、肝细胞癌 (HCC)、非小细胞肺癌 (NSCLC) 和黑色素瘤的肿瘤浸润性白细胞 (TIL) 的深入单细胞分析。这些研究带来了新的见解并验证了先前关于不同癌症免疫浸润的发现，但癌症类型之间反应的不均匀性可能是肿瘤类型特异性免疫检查点表达模式的结果，需要对多个肿瘤的 TIL 表型进行全面比较。为了满足这一需求，我们应用质谱流式 (CyTOF) 分析了 85 名具有五种不同肿瘤类型的患者的免疫细胞亚群：NSCLC（n = 15）；RCC（n = 25）；微卫星不稳定的结直肠癌（CRC；n = 11）、前列腺癌（PCa；n = 21）；以及多形性胶质母细胞瘤（GBM；n = 13）。

肿瘤浸润性白细胞表型的鉴定

首先比较了每种肿瘤类型中存在的主要免疫浸润。我们观察到 NSCLC、RCC 和 CRC 肿瘤富含CD3+ T 细胞，其中 CD4+ FoxP3+细胞在 CRC 中最常见（图1a）。虽然 PCa 和 GBM 都很难被 CD3+ T 细胞浸润，但 GBM 具有更高丰度的 CD68+ 骨髓细胞（图1a）。为了识别不同肿瘤类型的共享表型，对 CD45+ 细胞进行了 PhenoGraph 聚类，确定了 18 个簇 (L1-18)，其中有 8 个 CD3+ T 细胞簇和 10 个 CD3- 簇，包括六个 CD68+ 骨髓簇和一个自然杀伤（NK）细胞簇（图1b）。我们确定了一组六个免疫簇，它们存在于所有五种肿瘤类型中。这些簇显示出高香农熵，这是衡量它们在肿瘤类型中分布的更高均匀性的指标。我们还确定了八个显示低香农熵值的免疫簇，表明肿瘤特异性分布（图1c）。

分析不同 T 细胞簇的频率，确定了 NSCLC、RCC 和 CRC 中的 CD3+ CD4+ PD-1 hi和 CD3+ CD8+ PD-1 hi簇（分别为 L3 和 L6）（图1d）。在分析来自 RCC 队列的外周血单个核细胞 (PBMC) 样本时，我们确定了分别与 L3 和 L6 簇相关的 T 细胞亚群 (P33 和 P24)。有趣的是，与对 ICT 无反应者相比，P33 和 P24 簇在有反应者中有所扩展。我们还注意到 CD4 + FOXP3 hi的丰度更高CRC 和 PCa 中的调节性 T 细胞 (L12) 和 CD8+ VISTA+ (L14) 细胞（图1d），这可能导致对 ICT 缺乏反应。来自三种 T 细胞浸润肿瘤类型（NSCLC、RCC 和 CRC）的 30 个样本的所有 CD3 门控细胞的 PhenoGraph 聚类揭示了 17 个簇。根据他们的 T 细胞聚类频率对所有这 30 个患者样本进行了层次聚类，并确定了三个主要亚组（I、II 和 III）（图1e）。更高频率的 T 细胞簇，T1（PD-1 hi ICOS+ CD4+ T 细胞，如 L3）和 T4（PD-1 hi CD8+ T 细胞，如 L6），在亚组 II 中观察到，主要包括 NSCLC 和 RCC，这两种肿瘤类型对 ICT 反应良好（图1f）。亚组 III 包括较高频率的簇 T2（CD4+ T 细胞）和 T3（CD8+ T 细胞），检查点受体表达低，而亚组 I 显示不同 T 细胞亚群的中频，具有高和低免疫检查点的表达。

图1：肿瘤浸润性白细胞表型的鉴定

CD73 hi巨噬细胞特异性地存在于 GBM 中

接下来，我们对从不同肿瘤类型的 CD45+ 细胞的 PhenoGraph 聚类中鉴定的 CD3- CD68+ 骨髓簇进行了深入分析。我们在肿瘤类型中观察到两个 PD-L1- 亚群（L5 和 L17）和两个 PD-L1+ 亚群（L1 和 L8）（图2a）。L5 被鉴定为 VISTA+ 子集，与 NSCLC 和 PCa 相比，在 CRC 中的出现频率更高。L17 也被确定为 VISTA+ 子集，但仅在 CRC 中发现。L1 被鉴定为所有肿瘤类型共有的骨髓亚群。

元集群 L8 是仅在 GBM 中发现的唯一子集（这通过手动门控进一步验证；图2a）。除了 VISTA 和 PD-1 等其他共抑制分子外，L8 还表达高水平的 CD73。免疫组织化学 (IHC) 和免疫荧光研究进一步表明，人类 GBM 肿瘤具有高密度的 CD68+ 巨噬细胞，它们共表达 CD73。为了证明我们对 GBM 中白细胞浸润的研究结果的有效性，我们分析了 CyTOF 在 9 名 GBM 患者的独立队列中的巨噬细胞和 T 细胞浸润。与第一个 GBM 队列相比，我们发现了相似的高频率 CD73 hi巨噬细胞和低 T 细胞数量。

CD73 是一种外切核苷酸酶，可与其上游信号分子 CD39 一起将细胞外 ATP 转化为腺苷。CD73已显示在 GBM 中促进肿瘤进展并诱导免疫抑制。为了更深入地了解可能定义 CD73 hi骨髓细胞的基因，我们对另外四个 GBM 肿瘤进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。该分析揭示了 17 个集群，其中 4 个是 CD3+ T 细胞簇和10个是 CD3- CD68+ 骨髓细胞簇。在10个骨髓簇中，4个是 CD73 hi（R7、R14、R3 和 R17；图2b，由箭头指示）。我们发现 CD73 hi骨髓簇具有高表达的基因，表明血液来源的巨噬细胞特征与小胶质细胞特征相反（图2c）。CD73 hi巨噬细胞也表达CCR5、CCR2、ITGAV/ITGB5和CSF1R，表明 CD73 hi巨噬细胞可能通过这些因素被招募到 GBM肿瘤微环境中（图2d）。我们还评估了 CD73 hi骨髓细胞的免疫刺激或免疫抑制基因的表达，发现 CD73 hi骨髓细胞具有免疫抑制和缺氧相关基因的高表达（图2e）。

图2.CD73 hi巨噬细胞特异性地存在于 GBM 中

CD73 hi骨髓细胞在 PD-1 治疗后持续存在，并且与 TCGA GBM 队列中的总体存活率降低相关

接下来，我们使用四个 CD73 hi簇（R7、R14、R3 和 R17）获得了 CD73 hi巨噬细胞特异性的基因特征。MARCO、TGFB和几个SIGLEC基因在 CD73 hi细胞中表达（图3a）。为了了解基因特征的重要性，我们评估了 CD73 hi基因特征与生存的潜在相关性。为了进行这项分析，我们使用了癌症基因组图谱 (TCGA) GBM 队列 ( n = 525)。我们发现总生存期与 CD73 hi的高表达呈显著负相关TCGA GBM 队列中的基因特征（图3b，P = 0.013，风险比（HR）= 1.268）。基于 CD73 hi骨髓细胞的潜在免疫抑制功能，我们评估了来自接受抗 PD-1 治疗的患者的 GBM 样本，以确定这些细胞的流行是否可能与缺乏对治疗的反应相关。我们使用了一个由 5 名 GBM 患者组成的队列，他们参加了一项评估帕博利珠单抗对复发性 GBM 患者的疗效的 II 期研究（NCT02337686）。PhenoGraph 聚类 7 个未治疗的肿瘤和 5 名接受 pembrolizumab 治疗的 GBM 患者的队列显示 17 个聚类，包括 13 个子集，其特征为 CD3- CD68+ 骨髓亚群、两个 CD3+ T 细胞亚群和一个 NK 细胞 CD3- CD56+ 亚群（图3c、d）。在 12 个 CD68+ 骨髓亚群中，有 3 个 CD73 hi骨髓簇（图3d)；G2、G8 和 G11，由红色箭头指示）。在比较未处理的与抗 PD-1 处理的 GBM 样本时，我们发现尽管用 ICT 处理，这三个 CD73 hi骨髓簇仍然存在（图3e）。评估剩余的 CD73 lo或 CD73的髓样簇-尽管接受了 ICT 治疗，但也持续存在，这与先前研究的结果一致，在该研究中，抗 PD-1 治疗后骨髓细胞标志物没有变化。值得注意的是，鉴定出两个 T 细胞簇（图3d；G3 和 G6，由蓝色箭头指示），分别代表 CD4 和 CD8，未显示出未处理和抗 PD-1 处理之间的任何显著差异GBM 肿瘤（图3f）。根据最近的一项研究表明，未治疗和抗 PD-1 治疗的肿瘤的基因集富集分析显示，抗 PD-1 治疗的患者中 IFN-γ 反应基因的表达较高（图3g）。新辅助治疗中抗 PD-1 治疗的临床益处. 我们的研究结果表明，尽管可能在 TIL 中诱导适度的免疫反应，但抗 PD-1 治疗不会深刻改变 GBM 肿瘤微环境，其特点是其高含量的 CD73 hi骨髓细胞。CD73 hi骨髓细胞的流行可能导致缺乏 T 细胞浸润，从而导致不良的临床结果。

图3.CD73 hi骨髓细胞在 PD-1 治疗后持续存在，并且与 TCGA GBM 队列中的总体存活率降低相关

CD73 的缺失增强了 ICT 在 GBM 小鼠模型中的功效

接下来，我们评估了 CD73 介导的巨噬细胞表型变化是否会影响 ICT 的功效。我们用抗 PD-1 抗体或抗 PD-1 和抗 CTLA-4 抗体的组合治疗 GBM 荷瘤小鼠。(图4a)显示了来自未治疗和 ICT 治疗小鼠的 GBM 肿瘤的代表性 MRI 图像。与未治疗的对照组相比，在用抗 PD-1 加抗 CTLA-4 的组合治疗的 WT 和 CD73 - /-小鼠中观察到存活率的显著改善（ P < 0.0001；图4b）。重要的是，在联合使用抗 PD-1 和抗 CTLA-4 治疗后，与 WT GBM 荷瘤小鼠相比，CD73 -/-小鼠的存活率有所提高（ P = 0.03；图 1,4b）。我们没有发现抗 PD-1 治疗对 WT 和 CD73 -/-小鼠有任何显著的生存益处（图4b）。我们注意到，与WT小鼠相比，CD73 -/- 小鼠中iNOS +免疫刺激性巨噬细胞与CD206 +免疫抑制性巨噬细胞的比例显著更高。这在接受联合治疗的荷瘤小鼠中更为明显。类似地，与WT小鼠相比，CD73 -/-小鼠中颗粒酶B + CD8 T细胞与CD206 +免疫抑制性巨噬细胞的比例显著高于WT小鼠，并且在联合治疗后进一步显著（图4c，d）。因此，我们的数据表明，使用组合 ICT 增加的 T 细胞浸润，再加上 CD73 -/-小鼠中巨噬细胞对免疫刺激表型的极化，在确定对 ICT 的反应中起关键作用。

图4.CD73 的缺失增强了 ICT 在 GBM 小鼠模型中的功效

总结

提供了来自多种不同人类肿瘤和 GBM 患者的抗 PD-1 临床试验的免疫分析数据。我们确定了 CD73 hi骨髓细胞群特别存在于 GBM 中，即使在用抗 PD-1 治疗后仍然存在。此外，我们从与 TCGA GBM 队列中的总体存活率负相关的 CD73 hi骨髓细胞簇中获得了一个基因特征。scRNA-seq 显示 CD73 hi骨髓细胞富含免疫抑制基因，并且具有不同于常驻小胶质细胞特征的特征。CD73 hi骨髓细胞的进一步特征在于趋化因子/趋化因子受体如CCR5的更高表达，CCR2、ITGAV/ITGB5和CSF1R。尽管几项临床试验正在测试靶向这些个体趋化因子受体在包括 GBM 在内的晚期实体瘤患者中的效用，但这些受体在 CD73 hi骨髓细胞中的累积表达表明 CD73 本身是一个更相关的靶标，因为它在大多数患者中高度表达表达所有这些受体的细胞。例如，针对 CSF1R 的临床试验已证明其临床疗效有限，这可能是由于持续存在表达其他免疫抑制标志物的髓系人群。

我们的数据表明免疫抑制性 CD73 在接受抗 PD-1 治疗的 GBM 患者中持续存在骨髓亚群，以及免疫检查点抑制剂在 CD73 -/-小鼠模型中的治疗益处。基于我们的数据和早期研究，我们提出了一种针对 CD73 加 PD-1 和 CTLA-4 双重阻断的联合治疗策略。抗 CD73 抗体在临床前和早期临床研究中取得了可喜的成果；因此，我们的数据具有临床应用，可用于快速转化 GBM 与当前可用的抗 CD73 抗体的联合疗法。