引物设计

用户1086810

发布于 2018-06-26 14:41:03

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文章被收录于专栏：点点滴滴

PCR可以算得上是各生物实验室的标配技术了。无论是基因定量、克隆、组装、突变、测序……都离不开基于PCR的实验。目前，PCR相关试剂、耗材及仪器已经发展得相当成熟，包括聚合酶以及缓冲液的优化，使得扩增能力、保真度和兼容性均得到极大的提高。因此我们不再需要像过去一样，分散部分注意力用于摸索热循环条件、调整反应体系各底物的浓度等。也就是说，整个PCR实验条件，基本可以模板化，而不需每做一个实验都从头开始摸条件。

然而PCR实验中，有一个环节是厂家无法帮我们优化的，那便是引物设计。本文第一部分将以人EGFR基因为例，手把手教各位用最简单的方法，设计用于实时定量PCR研究基因表达水平的引物。在第二部分还会简单介绍，如何用相同的在线工具来评价引物。

（注：本文仅介绍的引物设计方法，仅适用于染料法qPCR之于基因表达定量研究，不涉及其他应用。像ORF克隆，没有特别的方法，就是老老实实在ORF一头一尾设计一对，用DNAStar lasergene等软件可以辅助设计，或者自己手动。而如果要做点突变、插入、删除，或者多片段组装，可以使用NEB相应的在线工具。）

第一部分：用Primer Blast设计引物

首先，上NCBI搜人CRTC1基因。

往下拉，可以看到这个基因可能存在2种转录本。（NM开头的就是mRNA，其他暂时别管）

继续往下拉，找到各个转录本的具体信息，可以看到isoform 1和3共2个转录本。

以isoform 3为例，点击NM_001098482.1那个超链接，进入下面这个页面。

点击右方的Pick Primers，进入引物设计的Primer Blast页面。可以看到PCR Template那里已经帮你填好了。现在，其他地方暂时留空，把PCR product size的Max改成350。qPCR反应中，延伸时间一般不超过30 sec。按常规Taq酶的反应速度1 kb/min来计算，30 sec可以合成500 bp。但酶活性会随着反应时间的延长而下降，所以保守起见，将最大产物长度设为350 bp甚至更低比较合适。太短也不行，否则跟引物二聚体分不开，所以下限70不用改。如果硬是得不到什么合适的引物，那就把这个数字往上调，最好别超过500，要不然qPCR的反应条件就得改了（其实也就改延伸时间）。

接下来，Exon junction span选项改为Primer must span an exon-exon junction。这里的意思是，至少有一条引物跨过了外显子之间的连接处。这样就算有基因组DNA污染了cDNA，也不会被扩增出来，保证定量准确。当然如果有的基因硬是没有内含子，改了这个选项就会报错。

接下来的选项不用更改。Specificity check默认打钩，帮你跑引物特异性验证。Organism已经帮你自动填了人类（9606是Homo sapien的编号，你想研究其他物种，那就在一开始搜基因的时候搜对应的物种）。最后一行，如果你把钩打上的话，就会允许引物帮你扩增其他isoform（本例中就是isoform 1）。当然，这不代表着会把所有isoform一起扩增，或者说强制一起扩增。如果需要这么做，我们需要返回前面更改一下设置。这一点第一部分的末尾注明。

点击Get Primers按钮，就会帮你设计引物了。由于是在线工具，请耐心等待几十秒。有时候人多，可能需要等几分钟。

很快我们就会看到这个页面，返回了10对引物。按照前面的默认条件，这些引物的退火温度都在60℃左右。

按照这个方法设计出来的引物，我做了那么多基因，成功率基本接近100%。这个在线工具的算法也在不断优化，按照近两三年的使用情况来看，没有遇到过失败的。（尤其是使用比较良心和稳定的试剂。在国内我是用天根，在美国是用原名biotool刚更名为bimake的试剂。好吧你说是软文我也懒得反驳，反正我就用这两家。这里也没有钦定的意思，我也用过Qiagen，Biorad和Thermo的，也能做得很好，但贵。）

那如果要同时扩增isoform 1转录本，那怎么办呢？很简单，由于不同转录本之间同源性很强，基本上只有5’或者3’端有点差异，因此我们只需要指定引物落在所有转录本的共同区间就行了。

回到刚开始的页面，我们可以看到另外一个转录本1。后面第4个以后的外显子（就是绿色的小竖线）是所有转录本都完全一致的。也就是说，我们只要让反向引物落在第4个外显子之后，就可以把所有2个转录本一起扩增出来了。

注意：XM开头的不是我们需要的，那些是预测的转录本。

往下拉，这一例中我们可以随便点击任何一个转录本的NM那个超链接，比如还是isoform 3，进入同样的页面。但这次在点击Pick Primers之前，点击Highlight Sequence Features。

然后你就会看到页面的底下变成了这个模样。我们把高亮的序列设置为exon（Feature左边），并高亮第4个外显子。目测一下，这个外显子从380位碱基开始。记下这个数字。

回到上方，点击Pick Primers，并把正向引物的5’端边界设为380。注意，不是3’端边界。其他的选项，按照本文前面讲述的方法进行调整。然后点击Pick Primers按钮。

此时傲娇的程序就会跳出来抗议说，你这样会P出其他的isoform。然而这就是我们要的结果。于是把所有的钩都选上。

点击Submit，再耐心等一会，就能得到能够扩增所有isoform的引物了。

我们可以看到，10个引物都是至少从第四个外显子后才出现的。

如上图所示，这两个都是我们需要的！

一道细细的红线（尼玛，明明是黑线，不要骗，我读书少）后，我们继续！

用Primer Blast评价引物

有时候我们并不需要亲手设计引物，从文献或者数据库里面就可以找到。但在正式使用之前，我们可以利用Primer Blast来看看那些引物是否靠谱。

这里顺带介绍一下几个常用的引物数据库：

RTPrimerDB：RTPrimerDB: the real-time PCR primer and probe database

PrimerBank：PrimerBank

qPrimerDepot：https://primerdepot.nci.nih.gov/

具体如何使用就自己摸索了，都非常简单。

现在同样以人CRTC1基因为例，我们从PrimerBank搜到一对引物。这时候，前面的方法还是一致的，但此时，把数据库的引物序列输入到Use my own forward/reverse primer那里就可以了。PCR product size那里可以不用改，保持默认。但请更改下方的Exon junction span的设置为同前文所述一般。