乳腺癌第一层次降维聚类分群复现

生信技能树jimmy

发布于 2024-03-18 10:24:13

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发布于 2024-03-18 10:24:13

最近在复现一篇文章《A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environ- ments in human breast cancer》，它配套的数据在 E-MTAB-10607 中可以看到。这篇推文主要记录了文献中的第一次降维聚类分群的命名的过程。

文献中的第一次亚群命名

The main cell types were annotated based on the expression of established marker genes：

EPCAM/CDH1 for epithelial cells
CD3/CD4/CD8/NCR1 for the T and NK cell fraction
CD14/ITGAX/HLADRA for myeloid cells
PECAM1/VWF for endothelial cells
PDGFRB/FAP for fibroblasts
MS4A2 for mast cells and basophils
MS4A1 for B cells
Ig-encoding transcripts for plasma cells

实战 - 第一次亚群命名（0.1分辨率）

命名主要按照文章中的基因列表：

以及曾老师总结的marker基因列表：

命名代码如下：

# 文章中的基因marker:
 epithelial=c("EPCAM","CDH1")
  T_NK='CD3/CD4/CD8/NCR1';T_NK=trimws(strsplit(T_NK,'/')[[1]])
  myeloid='CD14/ITGAX/HLADRA';myeloid=trimws(strsplit(myeloid,'/')[[1]])
  endothelial='PECAM1/VWF';endothelial=trimws(strsplit(endothelial,'/')[[1]])
  fibroblasts='PDGFRB/FAP';fibroblasts=trimws(strsplit(fibroblasts,'/')[[1]])
  mast='MS4A2'
  B_cell='MS4A1'
  Plasma='IG'  # Ig-encoding transcripts???
  
  gene_list = list(
    Epithelial=epithelial,
    Endothelial=endothelial,
    Fibroblast=fibroblasts,
    'T and NK cell'=T_NK,
    Myeloid=myeloid,
    'B cell'=B_cell,
    'Mast cell/basophil'=mast,
    'Plasma cell'=Plasma
  )
  p2 = DotPlot( sce.all.int,  features = gene_list, 
                group.by = 'RNA_snn_res.0.1') + 
    theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, vjust = 0.5, hjust=0.5))
  p2    
  ggsave('paper-marker-0.1.pdf',width=12,height=10)
 #定义细胞亚群
 # 0.1 的分辨率
  celltype[celltype$ClusterID %in% c( 2,9,11 ),2]='Epithelial'  
  celltype[celltype$ClusterID %in% c( 3 ),2]='Endothelial'  
  celltype[celltype$ClusterID %in% c( 4,6 ),2]='Fibroblast'
  celltype[celltype$ClusterID %in% c( 10,0 ),2]='T and NK cell' # 0 有 CD3E,CD3D
  celltype[celltype$ClusterID %in% c( 1 ),2]='Myeloid'
  # celltype[celltype$ClusterID %in% c( 4 ),2]='B cell'
  celltype[celltype$ClusterID %in% c( 7 ),2]='Mast cell/basophil'
  celltype[celltype$ClusterID %in% c( 8 ),2]='Plasma cell' # IGHG1, MZB1, SDC1, CD79A（https://www.jianshu.com/p/15dddefc7038）

存在一些问题：

cluster5 的marker 基因是 TOP2A MKI67，这两个是哪个细胞类型的marker基因？

好像是增殖性的marker基因，与细胞周期有关吗？那这个细胞类型要保留吗？目前的处理是没有命名。

缺少了B cell的细胞亚群

尝试用ACT自动注释，也没有B cell

对比文章已有的注释和我的注释

发现B cell 在T and NK cell中，可能是分辨率不够的原因。cluster5在文章中是好几个细胞亚群，也有可能是分辨率的问题。

实战 - 探索合适的分辨率

尝试 0.2 的分辨率

B cell的marker 基因为：MS4A1和CD79A。在这个分辨率下，没有 B cell。

尝试 0.5 的分辨率

B cell 终于被注释出来了，是 cluster 8，所以后续更正采取0.5分辨率进行命名：

实战 - 第一次亚群命名（0.5分辨率）

0.5分辨率下有25个cluster。命名主要按照文章中的基因列表：

以及曾老师总结的marker基因列表：

最终注释得到的UMAP图如下：

命名如下：

# 文章中的基因marker:
 epithelial=c("EPCAM","CDH1")
  T_NK='CD3/CD4/CD8/NCR1';T_NK=trimws(strsplit(T_NK,'/')[[1]])
  myeloid='CD14/ITGAX/HLADRA';myeloid=trimws(strsplit(myeloid,'/')[[1]])
  endothelial='PECAM1/VWF';endothelial=trimws(strsplit(endothelial,'/')[[1]])
  fibroblasts='PDGFRB/FAP';fibroblasts=trimws(strsplit(fibroblasts,'/')[[1]])
  mast='MS4A2'
  B_cell='MS4A1'
  Plasma='IG'  # Ig-encoding transcripts???
  
  gene_list = list(
    Epithelial=epithelial,
    Endothelial=endothelial,
    Fibroblast=fibroblasts,
    'T and NK cell'=T_NK,
    Myeloid=myeloid,
    'B cell'=B_cell,
    'Mast cell/basophil'=mast,
    'Plasma cell'=Plasma
  )
  p2 = DotPlot( sce.all.int,  features = gene_list, 
                group.by = 'RNA_snn_res.0.5') + 
    theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, vjust = 0.5, hjust=0.5))
  p2    
  ggsave('paper-marker-0.5.pdf',width=12,height=10)
  
celltype=data.frame(ClusterID=0:24 ,
                        celltype= 0:24 )
    #定义细胞亚群
    celltype[celltype$ClusterID %in% c( 1,11,12,18,20,23,24,7 ),2]='Epithelial'
    celltype[celltype$ClusterID %in% c( 10,14,15,16,21,22 ),2]='Endothelial'
    celltype[celltype$ClusterID %in% c( 5,6,9,19 ),2]='Fibroblast'
    celltype[celltype$ClusterID %in% c(0  ),2]='T and NK cell' # 0 有 CD3E,CD3D
    celltype[celltype$ClusterID %in% c( 2,3,4 ),2]='Myeloid'
    celltype[celltype$ClusterID %in% c( 8 ),2]='B cell'
    celltype[celltype$ClusterID %in% c( 13 ),2]='Mast cell/basophil'
    celltype[celltype$ClusterID %in% c( 17 ),2]='Plasma cell' # IGHG1, MZB1, SDC1, CD79A（https://www.jianshu.com/p/15dddefc7038）
 
    head(celltype)
    celltype
    table(celltype$celltype)
    sce.all.int@meta.data$celltype = "NA"

对比文章已有的注释和我的注释

和原文的注释差别不大了呢，有进步

有疑惑的 cluster 命名

cluster 19 应该是Fibroblast还是Myeloid？看图像是Fibroblast，看marker基因像是 Myeloid。我最终鉴定为Fibroblast，这与文章中的相符合。
cluster 7 通过marker基因无法确定。
- ACT自动注释为：Endothelial cell of artery，也就是Endothelial。
- 从UMAP图中观察，我把它命名为了Epithelial。
- 与文章中的注释比较，在文章中被注释为了三个细胞亚群：Epithelial，Myeloid，T/NK cell。