三代测序100问（13）：三代纳米孔测序到底能测多长？

在三代测序技术的璀璨星空中，纳米孔测序以其独特的“实时、长读长”特性而备受瞩目。一个常常萦绕在研究者，特别是初学者心头的问题便是：“纳米孔测序到底能测多长？在时间足够的情况下，它的读长应该是没有上限的吧？” 这个看似简单的问题，实则触及了纳米孔测序技术的核心原理与实践边界。今天，我们就跟随李冕老师的思路，一同探寻答案。

纳米孔测序的“无限”潜力：原理上的“无天花板”

首先，我们需要明确纳米孔测序的一个显著优势：其读长在理论上并不受仪器本身的限制。这一特性源于其独特的工作原理：

• 在测序过程中，单个DNA或RNA分子在马达蛋白（motor protein）的牵引和调控下，以一定的速率穿过一个生物工程改造的纳米孔蛋白（nanopore）。
• 当核酸链上的不同碱基（或碱基组合）通过孔道时，会引起孔内离子电流产生特征性的波动。
• 高灵敏度的传感器实时捕捉这些电流信号的变化，并通过复杂的算法（basecalling）将其解码为碱基序列。

从这个过程中我们可以看出，只要输入的核酸分子足够长且不发生断裂，马达蛋白和纳米孔蛋白的复合体能够持续工作，那么信号采集就能一直进行下去。因此，纳米孔测序的读长上限并没有一个固定的“天花板”。

从理论到现实：制约读长的三大关键因素

既然理论上可以“无限长”，为何我们在实际应用中看到的读长并非如此呢？李老师为我们揭示了在实际操作中，纳米孔测序平均读长受到的几大关键制约因素：

1. 样本DNA的完整性——最主要的瓶颈：

“读长的瓶颈，往往在于样本制备，而非测序本身。”李老师一语中的。常规的DNA提取试剂盒，无论是在细胞裂解、柱纯化、离心还是洗脱等步骤中，都不可避免地会对DNA分子产生剪切力。大多数文献和厂家手册中都表明，通过常规柱式法提取的基因组DNA，其片段大小通常分布在10-50kb的范围内。这意味着，即使测序仪有能力测得更长，但输入的“原料”本身就决定了最终读长的上限。

1. 文库构建与测序过程的稳定性：

即使我们获得了超长片段的DNA，在后续的文库构建实验中，DNA分子仍可能因为移液、混匀等操作的剪切力而断裂。此外，测序芯片上的马达蛋白、纳米孔蛋白以及其镶嵌的生物膜，其活性和寿命也是有限的，不可能无限期地稳定工作。这些因素都会共同影响最终可获得的测序读长。

1. 超长DNA分子的物理特性——“堵孔”问题：

当DNA片段的长度过长时，它在溶液中更容易发生打结、缠绕，或形成复杂的二级结构。这些“疙瘩”在进入狭窄的纳米孔口时，可能无法被完全解开，从而导致孔道被堵塞，即所谓的“堵孔” 现象。一旦发生堵孔，该孔道的测序就会终止，这不仅影响了单条read的长度，也会降低整个测序芯片的数据产出。

实际数据表现：从常规到极限

综合以上因素，我们来看看纳米孔测序在实际应用中的读长表现：

• 常规读长分布：目前，在大多数应用中，纳米孔测序的平均读长通常控制在10kb到30kb之间，这与常规柱式法提取的DNA片段大小分布基本吻合。
• 超长读长记录：如果采用经过优化的超长片段提取和文库制备方案，例如使用磁珠法或苯酚-氯仿法进行温和提取，可以获得N50在50kb至100kb以上的惊人读长记录。但需要注意的是，由于“堵孔”现象的存在，这类超长文库的测序芯片产出（yield）往往会低于常规建库。
• 极限单条Read记录：目前，已公开发表的最长的单条纳米孔read记录大约在4Mb左右。然而，这种极限超长read的获得，很大程度上需要依赖于完美的样本、极致优化的实验流程和相当的“运气”，并不具备大规模、可重复的产出能力。

结语：追求“合适”，而非“无限”

总结一下：纳米孔测序技术确实具备产生超长读长的非凡能力，其读长没有理论上的“天花板”。但实际结果是一个受样本DNA完整性、文库构建方式和测序过程稳定性等多方面因素共同决定的复杂平衡。

在绝大多数应用场景下，我们追求的并非“无限长”，而是一个稳定、可重复且“足够长”的读长分布。对于基因组拼接、复杂结构变异检测、全长转录本测序等核心任务而言，几十kb到上百kb的读长已经足以提供关键的结构信息，帮助我们攻克二代测序难以逾越的障碍。