这些qPCR引物设计的骚操作，你造么？

三步搞定引物设计，就是这么牛！

在《酸谈实验室》课程中，猫大老师就曾详细介绍了利用OLIGO、DNAMAN等软件进行PCR引物设计的具体方法，虽然这些软件实操起来切实可行，但这些软件的获取安装甚是繁琐复杂，着实给研究者带了一定的麻烦。今天小编我就想介绍一些可华丽丽的无视软件下载过程的骚操作，可简单粗暴进行qPCR引物设计。

常规操作之检索CDS序列

第一步还是检索CDS区的序列，猫大老师曾在课程中介绍了利用NCBI数据库寻找CDS序列，但其实利用UCSC数据库也能找到CDS序列，而且UCSC数据库还会有一个额外的好处，在此先卖个关子，后续内容会再提到。

进入之后可在左边选择物种，在右边方框中输入基因名称。以人的E2F1基因为例，点击GO；

在打开的页面中选择需要的变体，点击进入；

点击红圈所指位置；

出现一个新的页面：

在该页面下方，点击红圈中的序号：

在新出现的页面中点击红圈位置；

即可得到结果，其中红色区域为UTR区，蓝色区域即为CDS区，其中每一个外显子的第一个碱基以及最后一个碱基都用橙色/浅蓝色标出了，这为我们下一步设计引物提供了方便。

我们将序列复制粘贴到Word文档中，为了方便起见，用Word中的替换稍作处理：在“查找内容”中输入“^#”，代表任意数字，“替换为”内容为空白，即可将所有数字删除；

骚操作之qPCR引物设计

虽然引物设计原则是老生常谈，但确实是重中之重，各位小伙伴还是得对其做到了如指掌。除了要在CDS区（即蓝色区域）进行引物设计，以下几个方面也是需要认真考虑的。

1. 引物长度在17-25bp之间

2. 引物最后一个碱基不要A或者T

3. CG不要太多

4. 避免过多重复序列，如AAAAA、CCCCC等

5. 定量产物长度200bp左右（不是太严格）

6. 至少跨越一个外显子设计引物（避免Trizol抽提的RNA中混有的基因组DNA也被扩增出来；这里用UCSC检索CDS区的优势就显现出来了，用NCBI是看不到外显子和外显子的分隔的）

那么依据上述原则，即可选一个满足上述条件的上游引物：

随后在距上游引物200bp左右处选择基本符合条件的下游引物，值得注意的是下游引物与所选择的序列是方向互补的。

如此即可获得一对qPCR的上下游引物：

上游引物：TCGCAGATCGTCATCATCTC

下游引物：GCCAGGTACTGATGGTCAG

当然，如果说以上方法比较考验人的眼力，那么以下两个网址可谓是设计qPCR引物的良心网站。其操作方法非常简单，依据实验需要设计相应参数后，黏贴相应序列，进行检索设计即可。

1）GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design：

网址：https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer#

2）Pick primers from a DNA sequence

网址：http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi

常规操作之Primer-Blast比对引物特异性

打开NCBI，进入Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）：

点击进入如下界面：

选择相应的物种和参考数据库

选好后点击Get Primers，一段时间后进入如下页面：

由结果可知，设计的引物Tm值相近，符合要求，但是有一个非特异性结果，有可能会导致非特异性扩增。

以上这些方法虽然简单粗暴，但是也基本上能满足多数时候的需要，如果你只是偶尔需要设计一两条引物，那么可以试试这些方法哦。