引物与探针设计Primer3 简单教程

Primer3 是一款广泛使用的引物设计软件，可以帮助用户设计适用于 PCR（聚合酶链式反应）和其他分子生物学实验的引物。它是一个免费的在线工具，也有桌面版本，适用于各种平台。通过本教程，你将学会如何使用Primer3 在线工具设计引物。

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1. 访问 Primer3 网站

首先，打开 Primer3 的官方网站：

[Primer3 在线工具](http://primer3.ut.ee/)

你将看到一个用于引物设计的界面，允许输入目标序列并设置不同的设计参数。

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2. 输入目标 DNA 序列

在 Primer3 页面上，找到 "Sequence"（序列）框，粘贴你要设计引物的目标 DNA 序列。确保：

- 序列为 5' 到 3' 方向（通常你会使用基因或模板的 DNA 序列）。

- 序列不要包含额外的空格、标点符号或格式问题。

例如，你可以粘贴以下 DNA 序列：以 beta actin 为例，随意从genebank 复制粘帖的

```

1 cacgccggcc atgtacgtgg ccatccaggc cgtgctgtcc ctgtacgcct ctggccgcac

61 cactggcatt gtcatggact ctggggatgg ggtcacccac acggtgccca tctacgaggg

121 gtacgccctg ccccacgcca tcctgcgtct ggacctggct ggccgggacc tgaccgacta

181 cctcatgaag atcctcacgg agcggggcta cagcttcacc accacggccg agcgggagat

241 cgtgcgggac atcaaggaga agctctgcta cgtcgccctg gacttcgagc aggagatggc

301 caccgccgcg tcctcctcct ccctggagaa gagctacgag ctgcccgacg gccaggtcat

361 caccatcggc aacgagcgct tccggtgtcc agaggcgctc ttccagccct ccttcctggg

421 taggtgtcgg gcagcgcggc ctgcctgggg ggggcccggg ggctcgtccc cttgcacggg

481 ggaccgctaa gggggcgctc tgtcggcctc tcaggcatgg agtcctgcgg catccacgag

541 accaccttca actcgatcat gaagtgcgac gtggacatca ggaaggacct ctacgccaac

601 ac

```

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省略各种参数设置步骤，直接按照默认参数出结果，

点击

Pick Primers 就好了

5. 查看并选择引物

Primer3 Output

WARNING: Numbers in input sequence were deleted.

PRIMER PICKING RESULTS FOR

Template masking not selected

No mispriming library specified

No internal oligo mishyb library specified

Using 1-based sequence positions

OLIGOstart  len      tm     gc%  any_th  3'_th hairpin seq

LEFT PRIMER60   20   59.19   55.00   11.87   0.00    0.00 ccactggcattgtcatggac

RIGHT PRIMER297   20   58.89   55.00    0.00   0.00    0.00 atctcctgctcgaagtccag

INTERNAL OLIGO255   20   59.81   55.00    0.00   0.00   44.74 aggagaagctctgctacgtc

SEQUENCE SIZE: 602

INCLUDED REGION SIZE: 602

PRODUCT SIZE: 238, PAIR ANY_TH COMPL: 0.00, PAIR 3'_TH COMPL: 0.00

1 cacgccggccatgtacgtggccatccaggccgtgctgtccctgtacgcctctggccgcac

>

61 cactggcattgtcatggactctggggatggggtcacccacacggtgcccatctacgaggg

>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

121 gtacgccctgccccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgacta

181 cctcatgaagatcctcacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagat

241 cgtgcgggacatcaaggagaagctctgctacgtcgccctggacttcgagcaggagatggc

^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^   <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<

301 caccgccgcgtcctcctcctccctggagaagagctacgagctgcccgacggccaggtcat

361 caccatcggcaacgagcgcttccggtgtccagaggcgctcttccagccctccttcctggg

421 taggtgtcgggcagcgcggcctgcctggggggggcccgggggctcgtccccttgcacggg

481 ggaccgctaagggggcgctctgtcggcctctcaggcatggagtcctgcggcatccacgag

541 accaccttcaactcgatcatgaagtgcgacgtggacatcaggaaggacctctacgccaac

601 ac

KEYS (in order of precedence):

>>>>>> left primer

<<<<<< right primer

^^^^^^ internal oligo

ADDITIONAL OLIGOS

start  len      tm     gc%  any_th  3'_th hairpin seq

1 LEFT PRIMER        321   20   58.97   60.00    0.00   0.00    0.00 ccctggagaagagctacgag

RIGHT PRIMER       551   20   58.65   50.00    0.00   0.00    0.00 ttgaaggtggtctcgtggat

INTERNAL OLIGO     409   20   59.73   60.00   11.82   0.00   45.39 ctccttcctgggtaggtgtc

PRODUCT SIZE: 231, PAIR ANY_TH COMPL: 3.92, PAIR 3'_TH COMPL: 3.92

2 LEFT PRIMER        168   20   58.52   55.00    0.00   0.00    0.00 acctgaccgactacctcatg

RIGHT PRIMER       340   20   58.97   60.00    0.00   0.00    0.00 ctcgtagctcttctccaggg

INTERNAL OLIGO     279   20   60.10   55.00    0.00   0.00    0.00 tggacttcgagcaggagatg

PRODUCT SIZE: 173, PAIR ANY_TH COMPL: 0.00, PAIR 3'_TH COMPL: 0.00

3 LEFT PRIMER         71   20   59.53   60.00    0.00   0.00    0.00 gtcatggactctggggatgg

RIGHT PRIMER       264   20   59.46   55.00    0.00   0.00    0.00 agcttctccttgatgtcccg

INTERNAL OLIGO     168   20   59.45   55.00    0.00   0.00    0.00 acctgaccgactacctcatg

PRODUCT SIZE: 194, PAIR ANY_TH COMPL: 0.00, PAIR 3'_TH COMPL: 2.99

4 LEFT PRIMER        398   19   59.09   63.16    0.00   0.00    0.00 ctcttccagccctccttcc

RIGHT PRIMER       587   20   59.10   55.00    0.00   0.00    0.00 tccttcctgatgtccacgtc

INTERNAL OLIGO     531   20   60.31   55.00    0.00   0.00    0.00 catccacgagaccaccttca

PRODUCT SIZE: 190, PAIR ANY_TH COMPL: 0.00, PAIR 3'_TH COMPL: 0.00

Statistics

con   too    in    in   not          no    tm    tm   high  high  high        high

sid  many   tar  excl    ok   bad    GC   too   too any_th 3'_th hair-  poly   end

ered    Ns   get   reg   reg   GC% clamp   low  high  compl compl   pin     X  stab    ok

Left2967     0     0     0     0  1032     0   147  1249      0     0    18    17     0   504

Right2968     0     0     0     0   953     0   205  1179      0     0     5    17     0   609

Intl5805     0     0     0     0   320     0   162  4485      0     0     9     0     0   829

Pair Stats:

considered 340, unacceptable product size 335, primer in pair overlaps a primer in a better pair 255, ok 5

libprimer3 release 2.4.0

(primer3_results.cgi release 4.1.0)

生成的引物结果将出现在页面的下半部分，通常包括：

- Forward primer (正向引物)：该引物将用于 PCR 反应中扩增目标序列的正义链。

- Reverse primer (反向引物)：该引物将用于扩增目标序列的反义链。

每对引物都将列出以下信息：

- 引物的 序列。

- 引物的 Tm 值（熔解温度）。

- 引物的 GC 含量。

- 目标产物的大小。

- 引物的起始位置。

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6. 选择最佳引物对

- 根据设计的引物的熔解温度（Tm）、GC 含量、长度等信息，选择一对最适合的引物。

- 注意避免选择可能会形成二聚体、发夹结构或其他非特异性扩增产物的引物。

- 确保选择的引物能够在预期的 PCR 条件下高效地扩增目标区域。

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7. 导出引物序列

在确认选择了最佳引物后，可以将引物序列复制到文本文件中，或记录在实验记录中。

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8. 高级功能（可选）

如果你需要设计更多的引物或进行多次设计，可以使用 "Multiple primer pairs" 功能，这样可以同时设计多对引物。

- 选择多个目标区域。

- 设置多个扩增产品的大小。

- 设计多个引物对并进行比较。

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3. 设置引物设计参数

下面是一些常用的参数，可以帮助你根据需要优化引物设计。

3.1 基本参数

- Primer size (引物大小)：

- 设置引物的大小范围（通常为 18-24 碱基对）。可以通过 “Primer size” 选项设置。

- Product size (扩增产物大小)：

- 设置目标产物的大小范围（通常为 100-500 bp）。例如，可以设置扩增产物为 100 到 300 碱基对。

- Melting temperature (Tm) (熔解温度)：

- 设置引物的熔解温度范围，通常为 55°C 到 65°C。熔解温度决定了引物与模板 DNA 结合的强度。

- GC content (GC含量)：

- 推荐设置在 40%-60% 之间，因为适当的 GC 含量有助于稳定性和特异性。

3.2 高级设置

- Max self-complementarity (最大自互补性)：

- 选择最大自互补性，以避免引物自己形成二聚体或发夹结构。

- Max 3' complementarity (最大 3' 互补性)：

- 设置引物的 3' 末端互补性，避免引物在 3' 端产生不必要的退火。

- Max primer dimer (最大引物二聚体)：

- 控制引物之间是否形成二聚体，以确保引物之间的特异性。

3.3 输出格式设置

- Output format (输出格式)：

- 可以选择输出引物序列、Tm 值等信息的格式。通常选择“Primer3 format”即可。

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4. 点击“Pick Primers”按钮

在设置好所有参数后，点击页面底部的 "Pick Primers" 按钮。Primer3 将根据你输入的目标序列和设置的参数生成一组引物。

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小贴士：

- 优化设计：如果设计的引物不符合要求，调整参数（如Tm范围或GC含量）并重新设计。

- 实验验证：在实验中验证设计的引物是否能有效扩增目标序列，并且无非特异性扩增。

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总结

使用 Primer3 设计引物是一个直观的过程，关键在于调整合适的参数，以确保设计的引物具有良好的特异性和扩增效率。通过此工具，你可以快速设计适用于各种PCR实验的引物，并进行优化，确保实验成功。