提高基因干扰效率的技术方法

一、设计高效的siRNA/shRNA靶点序列并设置合理对照

RNAi是通过与靶基因互补来引发基因沉默，单个碱基的错配将导致靶基因沉默失效。这种siRNA作用的非特异性，可对靶基因之外的其它基因发挥沉默作用，导致脱靶，所以设计针对靶基因高效的干扰序列是RNAi成功的关键。

可以参考sigma网站收录的验证过的 pLKO.1 载体序列以及文献报道过的有效序列，其次考虑Thermo在线设计工具：BLOCK-iT RNAi Designer ，选择五星的靶点。

参考siRNA的设计原则：

1. 长度为21个碱基为宜；

2. 从起始密码子下游50- 100bp开始设计，避开终止密码子，尽量设计在CDS区，避开5’和3’UTR区；

3. 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其 3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点；

4. siRNA序列的GC含量应为30%-55%左右；

5. 和基因组数据库进行比较，选择特异性靶点，排除同源序列，减少脱靶效应；

6. 正义链的第三位为A, 第十位为U，第十五位到十九位A/U，避免出现连续3个以上相同碱基。

为了避免RNAi-Off-target，RNAi干扰实验要设置合理的对照，同时使用两条或以上的siRNA来验证表型，用于排除非靶向效应导致的假阳性结果。

二、保证无RNA酶环境进行实验

环境和空气中含有大量的RNA酶，痕量的RNA酶即可对RNA造成严重的降解。必须使用DEPC水或RNase-free水对RNA产品进行稀释。实验过程中，需避免RNA产品与人体皮肤或未经去RNA酶的实验耗材接触。因呼吸产Th的气体和飞沫中均含有大量的RNA酶，所以必须佩戴口罩于超净工作台内进行实验操作。

三、优化转染条件

优化转染条件极其重要，不同的细胞和实验中，建议都进行最佳siRNA浓度和转染试剂浓度优化。若转染试剂的转染效率不佳，可以尝试更换其他转染试剂，不同的转染试剂操作可能会有很大差异，必须严格按照说明书进行实验。有条件的话可以更换效率更高的转染方法，如电转或病毒转染。

四、使用无抗培养基

转染6-8 h内，要使用无抗培养基。因为抗Th素对细胞有毒性，会影响siRNA的递送效果。

五、保证健康的细胞状态

使用传代50代内的细胞进行实验，传代太多的细胞转染效率会下降。转染前必须保证细胞处于健康的状态，状态不佳的细胞其转染效率通常也很低，且对干扰效率的检测也有很大的影响。

六、shRNA序列长度影响干扰效率

常规启动shRNA的是三型启动子U6或 H1， 适合启动300bp以内的短片段，末端需要4-6个连续的 T 来终止转录，而普通编码基因、miRNA、lncRNA基因的表达都是由广谱启动子CMV、SV40、EF1α、PGK、CAG等启动，可以启动较大的基因转录，需要polyA转录终止信号，但是缺少组织特异性。

Jiening He等人研究表明，在HEK293细胞中，shRNA碱基序列为19-21bp，loop环大小为6nt或9nt时的干扰效率更好（图1）。

图1.茎长度、环大小和shRNA反义链位置对RNAi效率的影响

七、Ago2的表达水平影响干扰效率

Ago2是蛋白沉默复合体（RISC）的核心组分，可以切断RNA使得RNA降解，达到阻止基因表达的目的。Jiening He等人研究数据表明提高Ago2表达水平能够增强干扰效率(图2)。

图2. Ago2的过表达增强shRNA介导的dsRed2荧光报告基因的敲低

作者：海星生物

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