Nat. Biotechnol. | 万亿级长读测序揭示土壤宏基因组中的生物活性分子

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宏基因组学通过分析从整体微生物群落中提取的 DNA，使研究人员能够探索无法培养的细菌的遗传多样性。长读长测序推动了宏基因组研究的发展，能够生成比以往更大的 DNA 装配。然而，由于难以分离高质量的 DNA，其在土壤微生物群落中的应用受限。研究人员开发了一种方法，可以释放高质量的大片段 DNA，并结合优化的纳米孔长读测序，生成兆碱基级别的装配。利用该方法，研究人员在单一样品中获得了数百个完整的环状宏基因组基因组。通过生物信息学预测与化学合成相结合，研究人员将非核糖体肽生物合成基因簇直接转化为生物活性分子，并发现了具有罕见作用机制的抗生素，这些分子对多重耐药病原体表现出活性。这一策略不仅拓展了对未培养细菌巨大遗传多样性的获取途径，也提供了将其转化为药物先导物的新方法。

短读长测序（如 Illumina）推动了细菌全基因组测序的普及，但大多数细菌仍无法在实验室培养，限制了其基因多样性的直接研究。短读长宏基因组分析能够揭示部分多样性，但因装配片段短，难以复原复杂群落中完整的基因组序列。土壤微生物群落尤其复杂，不仅多样性极高，而且 DNA 提取常伴随杂质，使高质量装配更具挑战。

为了探索环境微生物的生物合成潜力，必须获得长而连续的基因组装配，因为生物合成基因簇往往跨越数万碱基。长读长测序为此提供了机会，但仍需优化 DNA 提取与装配流程。研究人员在本研究中构建了完整的实验与计算管道，利用纳米孔测序结合改良提取方法，在土壤样本中获得了前所未有的基因组连续性，并成功将其中的基因簇转化为新型生物活性分子。

结果

大片段 DNA 的提取与长读长装配

研究人员通过密度梯度分离与洗涤步骤，去除了土壤中的杂质，得到类似实验室培养物的“纯净”细胞悬液。在优化提取与片段选择后，测序数据量达 2.5 Tbp，读长 N50 超过 30 kbp，比常见短读长技术长约 200 倍。装配结果包括数百个环状基因组，其中许多可视为完整的细菌基因组。这大幅提升了土壤宏基因组研究的分辨率。

完整与近完整基因组的获取

研究人员利用 rRNA 与 tRNA 的基准标准，从装配数据中鉴定出 563 个完整或近完整的基因组。其中，环状装配平均长度约 5 Mbp，线性装配平均约 4 Mbp，远超以往短读长组装结果。这些数据不仅扩展了对已知门类的认知，还首次为一些未培养类群提供了完整基因组，包括 UBP17 门与 Capsulimonadaceae 科等罕见群体。

生物合成基因簇（BGCs）的发掘

在完整或近完整基因组中，研究人员发现了大量生物合成潜力丰富的家族，例如 Streptomycetaceae 与 Pseudonocardiaceae。尤其是 Aquella 属，其基因组中 NRPS 类基因簇数量远超此前基于短读长的估计，显示出该类群可能是被忽视的重要天然产物来源。

定向装配与合成生物活性分子

研究人员通过隐马尔可夫模型搜索，筛选出含有 NRPS 基因片段的读段，并定向装配出 338 条大规模基因簇。随后，利用 synBNP 方法（生物信息学预测 + 全合成），从 20 个不同来源的 NRPS 基因簇预测并合成了 55 个候选肽。活性筛选发现其中 5 个分子具有显著抗菌活性，最终重点鉴定了两种新型抗生素：

• Erutacidin：一种结合心磷脂的广谱抗生素，对多重耐药金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌有效。
• Trigintamicin：一种靶向 ClpX 蛋白的抗生素，对金黄色葡萄球菌表现出高效活性，但谱系较窄。

作用机制研究

Erutacidin 被证实通过结合心磷脂导致细菌膜去极化，这是临床抗生素中少见的机制，因而对耐药菌株依旧保持高效。Trigintamicin 则直接结合细菌 ClpX 蛋白，影响其蛋白降解过程。研究人员通过突变体分析与热量滴定实验验证了其特异作用机制。这些结果表明，长读长宏基因组结合合成策略能够挖掘出具有独特作用靶点的抗生素。

讨论

研究人员展示了在土壤宏基因组中实现高质量长读长装配的可能性，并将其与合成化学相结合，成功从未培养微生物群体中发现新型生物活性分子。这一策略突破了短读长技术的限制，极大拓展了天然产物的发现空间。

尽管 2.5 Tbp 的测序深度仍不足以完全覆盖土壤中稀有的微生物暗物质，但结果已表明长读长测序在宏基因组学中的巨大潜力。未来，随着测序效率提升与人工智能在 BGC 功能预测中的应用，类似的工作流将不断改进并规模化。研究人员认为，这为系统性挖掘不可培养细菌群体中的活性分子奠定了基础，也为开发对抗多重耐药病原体的新药物提供了有力途径。

整理 | DrugOne团队

参考资料

Burian, J., Boer, R.E., Hernandez, Y. et al. Bioactive molecules unearthed by terabase-scale long-read sequencing of a soil metagenome. Nat Biotechnol (2025).

https://doi.org/10.1038/s41587-025-02810-w

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