三代测序100问（14）：三代纳米孔测序是否适用于短片段DNA？

当我们谈及三代纳米孔测序，脑海中浮现的第一印象往往是其无与伦比的长读长能力，从数万碱基（kb）到数兆碱基（Mb），它为基因组学研究带来了革命性的突破。然而，生命科学的探索并非总是“越长越好”。最近，李老师就被问及一个非常具体且前沿的问题：“我想做人体体液中cfDNA的测序，三代纳米孔测序是否适用于这类短片段DNA呢？” 今天，我们就来深入探讨纳米孔测序在片段大小“下限”上的表现。

cfDNA：源自细胞碎片的遗传信息宝库

首先，让我们了解一下cfDNA（cell-free DNA），即细胞游离DNA。当细胞凋亡或坏死时，其内的DNA会被释放到血液等体液中，并被核酸酶降解成小片段。由于受到核小体（nucleosome）的保护，这些降解过程并非完全随机，使得cfDNA的片段大小分布呈现出独特的规律：在约167bp处有一个典型的主峰，这恰好对应于一段DNA缠绕在单个核小体上的长度。绝大多数cfDNA片段的长度都在500bp以内。这些携带着来源细胞遗传信息的“碎片”，在肿瘤液体活检、无创产前检测（NIPT）等领域展现出巨大的临床应用潜力。

纳米孔测序的“全覆盖读长”特性与物理限制

纳米孔测序的一个核心特性是“全覆盖读长” ——它既能测长片段，也能兼顾短片段。理论上，只要核酸分子能够顺利通过纳米孔通道，就会产生可被检测的电流信号，从而转化为碱基序列。然而，理论与实践之间存在着一个关键的物理限制。李老师解释道：“电流信号的产生，并非是单个碱基通过孔道时形成的，而是大约5-6个碱基同时处于孔口附近，共同决定了当前时刻的信号状态。” 这意味着，如果DNA片段过短，它在孔道中停留的时间将非常有限，导致采集到的有效信号点数过少。在这种情况下，复杂的basecalling算法可能无法完成稳定可靠的模式匹配，最终导致碱基识别的准确度显著下降。

根据大量的文献报道和ONT官方资料，目前普遍认为100bp左右是纳米孔测序比较可靠的长度下限。低于这个长度的片段并非完全无法测出，但其序列质量往往会因为信号不足或信噪比过低而大打折扣。因此，对于以167bp为峰值的cfDNA，纳米孔测序是可以进行的，但在分析结果时，需要对可能出现的效率和准确性相对偏低的情况有所预期。

技术迭代：突破短片段测序瓶颈

面对短片段测序的挑战，ONT及其社区并未止步不前，而是通过化学和算法的双重优化，不断拓宽技术的应用边界。

1. 优化的建库流程：ONT官方推出了针对cfDNA优化的建库试剂盒（如SQK-NBD114.24）。其核心策略之一，是在短的cfDNA分子两端连接上总长约80bp的barcode和adaptor序列。这样做不仅是为了后续的数据拆分，更重要的作用是人为地“延长”了整个待测分子，增加了其在孔道中的有效停留时间，从而改善了信号采集的稳定性和碱基识别的准确性。
2. 短片段模式（Short Fragment Mode）：在测序控制软件MinKNOW中，用户可以选择启用“短片段模式”。该模式专为20-200bp范围的片段进行了优化，能够更灵敏地检测和捕获短分子。
3. 持续进化的算法：配合最新的碱基识别模型（如Dorado），短片段的识别准确率也得到了显著提升，使得从短读长中获取高质量序列信息变得越来越可行。

应用前景：cfDNA与纳米孔测序的“黄金组合”

cfDNA的微创获取方式，结合纳米孔测序仪便携、快速、实时输出的独特优势，正催生出一个充满想象力的“黄金组合”。这一组合已经在临床研究中展开了积极的探索，例如在肿瘤动态监测、早期筛查以及快速无创产前检测等领域。可以预见，随着建库化学、测序芯片和碱基识别算法的不断迭代更新，纳米孔测序在处理cfDNA等体液游离核酸方面的性能将持续提升。其在精准医疗和即时诊断（Point-of-Care Testing, POCT）领域的应用前景，无疑将越来越广阔。