空间组学 | 揭示小细胞肺癌肿瘤异质性和免疫群体生态位 | Cancer.Cell

Basic Information

• 英文标题：Integrative spatial analysis reveals tumor heterogeneity and immune colony niche related to clinical outcomes in small cell lung cancer
• 中文标题：整合空间分析揭示小细胞肺癌中与临床结局相关的肿瘤异质性和免疫群体生态位
• 发表日期：10 March 2025
• 文章类型：Article
• 所属期刊：Cancer Cell
• 文章作者：Haiquan Chen | Zhiwei Cao
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610825000303

Highlights

Para_01

1. 一个包含 165 名小细胞肺癌患者 CODEX 和多组学谱系的空间图谱
2. 细胞邻域表明肿瘤表型转换和肿瘤微环境变化
3. ColonyMap 算法检测到与生存优势高度相关的 MT2 生境
4. 基于 M1 型巨噬细胞的 MT2 生境预测了更好的免疫治疗反应

Summary

Para_01

1. 最近的研究进展揭示了小细胞肺癌（SCLC）的分子异质性，但肿瘤免疫微环境中的空间组织和细胞相互作用仍有待阐明。这里，我们采用索引共检测（CODEX）和多组学分析来描绘165名SCLC患者的时空图谱，生成了涵盖超过930万细胞的267张高维图像。
2. 整合CODEX和基因组数据揭示了ASCL1+（SCLC-A）亚型中的多阳性肿瘤细胞邻域，该区域以SLFN11高表达为特征，并与较差的预后相关。
3. 我们进一步开发了一种细胞集落检测算法（ColonyMap），并揭示了一个由抗肿瘤巨噬细胞、CD8+ T细胞和自然杀伤T细胞（MT2）组成的时空组装免疫龛，该免疫龛与较好的生存率高度相关，并能在独立队列中预测免疫治疗反应的改善。
4. 本研究为研究SCLC的空间异质性提供了宝贵的资源，并为潜在的患者分层和个性化治疗提供了见解。

Graphical abstract

Keywords

• spatial atlas; CODEX; tumor microenvironment; molecular heterogeneity; cell colony; prognostic marker; immunotherapy response

Introduction

Para_01

1. 小细胞肺癌（SCLC）是一种恶性肿瘤，其特点是快速生长、早期扩散和总体预后较差。
2. 尽管对铂类化疗药物的初始反应良好，但它迅速获得抗药性并导致疾病进展。
3. 虽然免疫治疗最近为SCLC的治疗带来了潜在的突破，但生存获益仅在一小部分患者中观察到。
4. 与非小细胞肺癌（NSCLC）和乳腺癌等其他癌症的生物标志物导向个性化治疗策略不同，SCLC长期以来一直被视为一种同质性疾病。
5. 直到最近，大规模的整体基因表达分析基于四种谱系定义转录因子（ASCL1 [SCLC-A]、NEUROD1 [SCLC-N]、POU2F3 [SCLC-P] 和 YAP1 [SCLC-Y]），提出了SCLC的分子亚型和肿瘤间异质性。
6. 最新的整体蛋白质基因组学研究从112名SCLC患者中识别出四种替代亚型，并建议了它们在细胞系和细胞系衍生的异种移植（CDX）/患者来源的异种移植（PDX）模型中潜在的不同治疗脆弱性的验证。
7. 除了上述的肿瘤间差异外，通过转基因小鼠模型中的时间序列单细胞转录组（scRNA-seq）分析还研究了SCLC的肿瘤内异质性，揭示了个体肿瘤内部存在多种分子亚型，这与潜在的治疗选择性相关。
8. 1 尽管初始响应良好，但通常预后较差。

Para_02

1. 上述基因组和转录组分析在整体和单细胞层面显著提高了小细胞肺癌（SCLC）异质性的深度，并提出了有前景的治疗选择。
2. 然而，在SCLC中，空间解析的肿瘤间和肿瘤内异质性、细胞组织以及它们与患者预后的关系仍然在很大程度上未被探索。
3. 高度多重成像技术如索引共检测（CODEX）的出现使得在保留甲醛固定的石蜡包埋（FFPE）组织中的单细胞空间地理信息的同时，捕获单细胞的分层分子参数成为可能，从而能够从单细胞解析的空间视角整合长期随访数据。
4. 通过原位分析，可以同时研究细胞功能"状态"、空间相互作用以及细胞邻域（CN）。
5. 例如，在不同的肺腺癌组织学亚型之间存在特定的细胞相互作用。
6. 通过CODEX技术已经在结直肠癌和黑色素瘤中识别出与抗肿瘤免疫相关的细胞邻域。
7. 然而，迄今为止，仍然缺乏将肿瘤-免疫相互作用与SCLC的预后和治疗反应相结合的空间地理图谱资源。

Para_03

1. 本文利用CODEX技术与复旦大学人类肺组织多组学图谱（HLTMA）队列中的35重抗体面板，在局限期小细胞肺癌患者中进行了研究，该队列具有标准化的组织获取和多组学分析流程，并附有临床注释。
2. 我们的研究生成了267张高维图像以及165名小细胞肺癌患者的全外显子、原位单细胞分辨率RNA和bulk RNA测序数据。
3. 通过系统化的地理分析，我们解析了超过930万个细胞，识别出显著的肿瘤内分子异质性，并描绘了伴随不同免疫微环境和基因组特征的空间CN转换轨迹。
4. 为了更好地探索空间组织和细胞相互作用，我们进一步开发了ColonyMap算法，并发现了一个抗肿瘤免疫细胞的空间聚集生态位，这可以预测小细胞肺癌患者的生存率和免疫治疗反应。
5. 综上所述，我们精心策划的数据和分析技术为后续的肿瘤学研究提供了宝贵的资源和框架。

Results

Spatially resolved single-cell phenotypic atlas in SCLC

SCLC中的空间解析单细胞表型图谱

Para_01

1. 为了全面描绘小细胞肺癌（SCLC）的细胞组成、空间组织和分子异质性，我们创建了一个多组学图谱，该图谱涵盖了来自HLTMA队列的所有临床病理特征的原发性SCLC肿瘤（复旦大学[FU]-SCLC队列）（表S1），并具有长期随访数据（中位随访时间：62.3个月；四分位距：36.1-113.0个月）。
2. 在这项研究中，用于全身治疗前的肿瘤组织被用于全外显子测序（WES）、bulk RNA测序（RNA-seq）和CODEX，以及空间分子成像（SMI）CosMx和免疫组化（IHC）染色验证（图1A和S1）。
3. 设计了一个包含35种抗体的面板（表S2）用于CODEX，以同时定量蛋白质，包括小细胞肺癌异质性的分子亚型转录因子（TFs）；上皮、间充质、免疫和内皮谱系的标记物，用于肿瘤微环境（TME）；以及细胞功能状态或正在进行临床药物试验的目标（图1B）。
4. 我们从129个肿瘤样本和16对相邻正常组织中获得了267张高维组织病理学图像（图1C和S1）。
5. 总共，我们检测了9,337,647个细胞，并使用监督谱系分配方法根据经典标记对细胞表型进行了分类（图1D和1E）。
6. 在肿瘤细胞（TCs）和免疫细胞中均表达的标记物被很好地识别，以便进行准确注释（图S1D）。
7. 例如，双阴性T细胞（dnT）被定义为CD3+CD4−CD8−CD56−T细胞。自然杀伤T细胞（NKT）被定义为CD3+CD4−CD8−CD56+T细胞，而CD3−CD56+细胞被注释为自然杀伤（NK）细胞（图S1C）。
8. 特别地，多阳性肿瘤细胞（MPTC）被检测到，其表型为共同表达两种或更多种阳性TF标记（图1E）。
9. 几乎所有通过CODEX成像的肿瘤（129个肿瘤中的120个）至少有两个核心（九个肿瘤一个核心，两个肿瘤三个核心），这使我们能够探索肿瘤内的空间异质性（图S2）。
10. 肿瘤组成比TME细胞表型在核心之间更好地保持一致，尽管存在例外情况。
11. 例如，YAP1+肿瘤细胞之间的相关性相对较弱，这可能是由于YAP1在肿瘤和间充质组织之间的非特异性表达模式（图S1D）。
12. 虽然CD68+巨噬细胞在来自同一肿瘤的不同核心之间得到了很好的保存，表明其相对较强的肿瘤浸润能力。
13. 总之，在SCLC中，不同区域的肿瘤和免疫微环境存在异质性，空间组学提供了优于传统bulk测序的领域分割和结构映射的优势。

图片说明

◉ 图1. FU-SCLC队列中的CODEX和多组学工作流程(A) FU-SCLC队列中平行组织分析方法的描述，包括IHC染色、bulk WES和RNA测序、SMI CosMx和高维CODEX成像，以及CODEX概述。(B) CODEX面板中使用的标记，按目标细胞类型或蛋白质类别分组。(C) CODEX图像数据的代表性示例（裁剪以适应）；比例尺，50 μm。(D) 一个肿瘤核心的代表性CODEX图像，叠加了六种颜色的癌症和免疫细胞谱系标记，以及相应的细胞分割掩膜图，通过颜色显示细胞身份，并叠加到掩膜上；比例尺，250 μm。(E) 热图显示所有标记在由CODEX识别的细胞表型中的平均表达。为了解释，MPTC被定义为检测到的具有共同表达两种或多种阳性转录因子的肿瘤细胞。dnT被定义为CD3+CD4−CD8−CD56− T细胞，NKT被定义为CD3+CD4−CD8−CD56+ T细胞。TC，肿瘤细胞；TH，辅助T细胞；Treg，调节性T细胞；NK，自然杀伤细胞；DC，树突状细胞。另见图S1和S2，表S1和S2。

CODEX queried layers of tumor heterogeneity in SCLC

CODEX查询了小细胞肺癌的肿瘤异质性层次

Para_01

1. 最近的研究通过对FFPE组织切片进行IHC检测，表明两种或更多TF标记物在同一SCLC肿瘤样本中共表达。
2. 探索分子和TME异质性的更详细信息是值得的。
3. 我们计算了各种TCs和免疫细胞的比例（表S1）。
4. ASCL1+ TCs占所有TCs的50%以上，而巨噬细胞是免疫细胞中最丰富的。
5. 令人震惊的是，超过10%的TCs（916,348个细胞）被鉴定为MPTCs（图2A和2B）。
6. 通过IHC（图2B和S3A）、scRNA-seq（图S3B）和SMI CosMx（图S3C）对连续切片进行了验证，并证实了MPTCs的存在。
7. 在这些MPTCs中，ASCL1和NEUROD1的共表达最为普遍，其次是ASCL1+YAP1+和NEUROD1+YAP1+细胞，少数表现出ASCL1+NEUROD1+YAP1+表型。
8. POU2F3的表达几乎与ASCL1和NEUROD1互斥，而YAP1显示出更普遍的表达模式（图1E）。
9. 最近使用GEMMs的研究阐明了SCLC中从ASCL1到NEUROD1再到YAP1的表型神经内分泌（NE）去分化轨迹。
10. 相反，POU2F3+细胞来源于一个独特的簇状细胞谱系，证实了我们的单细胞分辨率发现。
11. 在分析每个核心时，我们采用了类似于肺腺癌病理亚型的策略，其中选择了5%作为最低阈值，并将主要分子亚型定义为比例最高的表型。
12. MPTCs在各个表型类别中分别计数。
13. 例如，携带60% ASCL1+ TCs和20%混合ASCL1+NEUROD1+ TCs的患者将被分类为SCLC-A主要亚型，同时注释为ASCL1+/NEUROD1+杂交亚型（亚型计数= 2）。
14. 在我们的研究中，超过40%的SCLC-A核心中存在MPTCs，这表明了显著的肿瘤内分子异质性（图2C和S4A）。
15. 相关性分析揭示了ASCL1+ TCs比例与NEUROD1+/YAP1+ TCs比例之间存在显著负相关（图S4B）。
16. 使用bulk RNA-seq数据观察到，与SCLC-A主要亚型相比，SCLC-N/Y亚型中的NE分化相关基因表达降低，而非NE分化相关基因则呈现相反趋势（图S4C）。
17. 这表明这种分型策略可能表征了SCLC中的去分化过程。
18. 值得注意的是，一个肿瘤显示了三种分型表型：NEUROD1+、YAP1+和POU2F3+，这是一个罕见的情况，同样由Ireland等人观察到，14这需要进一步研究这些肿瘤的细胞起源和进化轨迹。

图片说明

◉ 图2. CODEX查询了小细胞肺癌（SCLC）中的肿瘤异质性层（A）单个肿瘤内的共表达模式示意图。（B）ASCL1+肿瘤（左），ASCL1+NEUROD1+肿瘤（中）和ASCL1+NEUROD1+YAP1+肿瘤（右）的代表性CODEX图像。第二面板显示每个转录因子的归一化表达，并通过免疫组织化学验证（第三面板）。叠加到细胞分割掩膜上的细胞表型图（第四面板，颜色对应于D和E中的细胞谱系）；标尺，100 μm。（C）表示每个核心中小细胞肺癌主要亚型百分比的饼图（内圈），以及所有五个组中外显子组合的百分比（外圈，附有图例）。Neg，阴性。（D）瀑布图描绘了每个小细胞肺癌主要亚型的核心水平上六种肿瘤细胞表型和总免疫细胞浸润的分布情况。（E）根据小细胞肺癌主要亚型（上图）和亚型计数（下图）的小细胞肺癌指示免疫细胞表型占所有细胞的百分比的堆积条形图。所有图表均在核心水平上。另见图S3-S5、表S1和S2。

Para_01

1. 随后表征了肺肿瘤免疫微环境（TIME）的细胞景观。
2. 首先对16个肿瘤及其配对的正常邻近组织进行了分析。
3. 与邻近正常组织相比，肿瘤中大多数免疫细胞类型的比例没有增加，只有CD56+ NK细胞的比例有所增加（图S4D上部面板），支持了SCLC"冷"免疫微环境的特点。
4. 在亚型中，SCLC-Y的免疫浸润程度最高（25.2%）（图2D和2E）。
5. 这种优势主要由骨髓区室内的变化驱动，尤其是巨噬细胞，在SCLC-Y与其他亚型之间存在显著差异（图2E和图S4D中部面板）。
6. 有趣的是，FOXP3+ Treg细胞簇的频率仅在SCLC-P亚型中显著更高，尽管SCLC中的Treg细胞总体频率较低（图2E和图S4D中部面板）。
7. 相应地，SCLC-P亚型患者的预后明显比其他亚型差，而SCLC-Y与我们数据集中最佳生存率相关（图S4E和S4F）。
8. 为了验证SCLC-Y亚型的免疫浸润水平，我们在全转录组测序数据中进一步识别出四个簇（图S5A和S5B）。
9. 在簇1中观察到了单一的SCLC-Y肿瘤，同时伴有SCLC-P。
10. 排除SCLC-P肿瘤后，簇1显示出比其他簇更高的免疫特征得分（图S5C）。
11. 我们还比较了scRNA-seq样本中YAP1+ TC比例大于或等于1%的样本与那些小于1%的样本之间的免疫浸润情况。
12. 前者表现出更强的免疫浸润（图S5D和S5E），验证了我们的CODEX发现。
13. 分析表明，SCLC-Neg肿瘤的免疫浸润水平相对较高（图2E），仅次于SCLC-Y肿瘤。
14. 这四重阴性TC主要在病理上表现为坏死和萎缩，可能被免疫系统抑制或清除。
15. 在亚型数量方面，未发现免疫学或患者生存率的显著差异（图2E、S5F和S5G）。
16. Analysis was firstly performed on 16 tumors and paired adjacent normal tissues.

Para_02

1. 在评估免疫细胞群与临床病理特征之间的关系时，我们调查了每个患者中各细胞类型占总细胞数的百分比。
2. 男性小细胞肺癌（SCLC）患者的总体生存率（OS）低于女性（图S4F），这可能与内皮细胞（ECs）的显著更高频率有关（图S4D下部面板）。
3. 研究发现，内皮细胞是唯一与短期生存率（STS）相关的细胞类型，尽管许多其他免疫簇在病理分期为I期的患者中富集，这些患者的生存率高于II-III期患者（图S4D下部面板和图S4F）。

Para_03

1. 总之，通过CODEX揭示了多种小细胞肺癌亚型之间分子标记物表达和免疫细胞组成的异质性。
2. 虽然据报道某些恶性肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞频率具有预后价值，30,31,32,33但在我们的研究中，没有检测到小细胞肺癌患者中单一免疫亚群丰度与生存率之间存在显著相关性，这需要进一步探讨细胞功能状态或更高维度的特征分析。

CNs marked spatial phenotypic transition and survival outcomes

标记了空间表型转换和生存结果的CNs

Para_01

1. 基于上述细胞频率和组成分析，我们进一步从空间角度探讨了细胞间相互作用和TIME。
2. 首先进行了置换检验，以量化各小细胞肺癌亚型之间细胞类型间的相互作用偏好（图S5H和S5I）。
3. 同型相互作用在TCs和免疫细胞群体中非常普遍，这与肺腺癌和乳腺癌中的相互作用分析一致。
4. 在同型T细胞相互作用中，SCLC-N和SCLC-Y亚型表现出CD8+ T细胞、CD4+辅助性T细胞（TH细胞）和dnT细胞之间的丰富相互作用（图S5H和S5I，框1a、1b）。
5. 值得注意的是，这些T细胞相互作用而非细胞比例与患者的长期生存相关（图S4D和S5H，右侧面板）。
6. 与其它亚型相比，在SCLC-Y肿瘤中，ECs更倾向于与炎性T细胞相互作用（图S5H，框2）。
7. 有趣的是，与其它亚型相比，在SCLC-P亚型中FOXP3+调节性T细胞（Treg细胞）显示出与CD8+ T细胞或NKT细胞之间更高的相互作用（图S5H和S5I，框1a，框3）。
8. 然而，这些相互作用独立于这些细胞类型的总体浸润情况（图S5J）。

Para_02

1. 我们接下来探讨了CN在SCLC各亚型中的肿瘤内异质性和TIME组织情况。
2. 采用一种经典方法18建立了20个CN簇，这些簇重现了新的和已知的TIME架构（图3A和3B），包括泛免疫（CN1）、巨噬细胞富集（CN12）、血管（CN5）等。
3. 值得注意的是，这种CN分析进一步根据每个TC的空间关系和比例对局部肿瘤巢进行了分层，包括几个MPTC富集的区域（CN2、CN9、CN13和CN14）。
4. 为了识别与生存相关的CN，使用CN比例作为变量，在调整TNM分期的情况下进行了多变量Cox回归分析，考虑到肿瘤分期是重要的预后因素（图S6A）。
5. 在整个患者群体中，邻里比例与OS不相关。
6. 当限制在主要为SCLC-A亚型的患者中时，CN7（富含YAP1+ TC）、CN9（富含MPTC）和CN10（富含NEUROD1+ TC）表现出与较差预后的显著关联，而CN17（富含ASCL1+ TC）与改善的生存率相关（图3B）。
7. 这表明在一个主要为ASCL1+的肿瘤中，其他亚型的出现预示着不良预后。
8. 在其他主要亚型中未观察到类似的趋势（表S3）。

图片说明

◉ 图3。CNs标记了空间表型转换和生存结果（A）细胞邻域（CN）分配的工作流程示意图。右侧使用Voronoi图进行CN映射。（B）表示跨CN的细胞组成热图（n = 251张图像；n = 20个最近的细胞；CN = 20个邻域）。右侧的p值是基于CN频率，调整病理TNM分期后，使用多元Cox比例风险回归模型计算的SCLC-A主要样本（在患者水平）的p值。红色字体表示与较差的预后相关，蓝色字体则相反。（C）仅ASCL1+ SCLC-A亚型和ASCL1+ NEUROD1+ SCLC-A亚型的CNs代表性Voronoi图（上部面板）和下部面板）。（D）在核心水平上五个CNs在SCLC-A主要亚型中的存在或不存在情况。p值通过卡方检验计算。（E）使用（D）中的五个CNs频率作为变量，通过Monocle 2计算的伪时间轨迹（上部面板）。投影到伪时间空间中的CN3和CN9位置（下部面板）。（F）比较CN3中的ASCL1+ TCs、CN9中的MPTCs和CN10中的NEUROD1+ TCs的功能标记表达。计算标记阳性细胞的比例。（G）显示ASCL1+ NEUROD1+ SCLC中SLFN11在MPTC中高表达但不在仅ASCL1+区域（白色虚线）的代表性CODEX图像叠加；比例尺，50 μm。（H）CN3和CN9（在患者水平）中最富集的前五种体细胞突变或拷贝数异常。针对每个肿瘤内相同核心的靶向CN比例平均值。气泡图中圆圈代表广义线性模型的系数。气泡大小与估计精度成反比。条形图说明了改变的比例。另见图S5和S6，表S1和S3。

Para_02

1. SCLC中TFs的共表达实际上已经在几项研究中被揭示，而这些MPTCs在整体RNA测序数据中无法很好地定义。
2. 在四个富集的MPTC邻域中，CN9是唯一与预后相关的结构。
3. 因此，我们采用了Voronoi映射来模拟CN的空间分布作为可视化（图3C和S6B和S6C）。
4. Voronoi地图与原始CODEX荧光模式很好地对齐。
5. 在混合SCLC-A肿瘤中，我们观察到多个MPTC富集的邻域呈同心环状排列，CN9位于中心，周围由CN2和CN13包围，形成"虫蛀"模式（图3C）。
6. CN9区域对应于非ASCL1标记物的表达。
7. 使用了每个CN的发生顺序和伪时间轨迹分析，结果显示CN3在伪时间上比CN9更早出现（图3D和3E）。

Para_03

1. 我们随后对所有MPTC进行了t分布随机邻居嵌入（t-SNE），观察到几种功能标记物的表达分布不同，例如Ki67和 Schlafen 11（SLFN11）（图S6D）。
2. 与CN3相比，CN3很少表达上皮间质转化（EMT）的标志物波形蛋白，发现CN9中的波形蛋白阳性TC比例显著升高（图3F）。
3. CN9中TC的增殖比例（Ki67+）也相对高于CN3。
4. 这些发现表明，在去分化过程中，TC具有较高的增殖和转移潜力，部分解释了其与不良预后的关系（图3B）。
5. 来自SCLC-A亚型细胞系衍生的小鼠肿瘤的单细胞RNA测序数据显示，远处转移肿瘤中的MPTC比例相对增加（图S6E和S6F）。
6. 考虑到波形蛋白也可以表征去分化的程度，我们分析了CN10，并观察到CN10中波形蛋白的表达比CN3和CN9有所增加（图3F），这与线性轨迹假说相吻合。
7. 此外，CN9和CN10中SLFN11阳性TC的比例显著升高（图3F和3G）。
8. SLFN11是一种DNA/RNA解旋酶，可使癌细胞对DNA损伤剂敏感，也被确定为多聚ADP核糖聚合酶抑制剂（PARPi）的关键预测因子35,36,37。
9. 先前的研究证实了SCLC-A肿瘤中SLFN11的双峰表达模式10。
10. 我们的研究结果表明，SLFN11的表达可能伴随SCLC的去分化轨迹，SLFN11阳性MPTC的比例可能在未来PARPi临床试验的设计中被考虑。

Para_04

1. 同时，从体细胞突变和拷贝数变异（CNV）的角度探讨了CNs与基因组改变之间的关系（图3H）。
2. 我们首先计算了同一肿瘤内每个核心的靶向CN比例的平均值，随后将这些平均值与遗传事件相关联。
3. CN3与体细胞突变的相关性较低，但BRCA238,39,40和B2M丢失更为丰富，后者可能介导肿瘤免疫逃逸和免疫检查点阻断（ICB）抗性。
4. CN9携带了最多的RBBP6突变，据报道这会导致上皮间质转化（EMT）过程并促进肿瘤转移。
5. CREBBP改变是NEUROD1+ TC富集区域（CN10）的首要命中，并且可能与化疗后的SCLC复发有关。
6. 此外，发现EYA2突变与CN11相关，CN11是一个富含SCLC-P亚型的簇（图3H）。
7. EYA2先前被鉴定为一个关键调节因子，它上调MYC表达并介导TC中的免疫逃避，这与SCLC-P亚型中高Treg频率相呼应。

Para_05

1. 简而言之，这些结果表明了一个富含MPTC的特殊邻域（CN9），其特征是高转移潜力、高SLFN11表达以及与SCLC-A肿瘤不良预后的关联。
2. 这种结构可能与特定的体细胞改变相关，例如RBBP6，它也被称为p53的负调控因子。
3. SCLC中CN9结构与p53和RBBP6改变之间的详细关系仍需进一步研究。

ColonyMap detected spatially assembled colonies of SCLC

ColonyMap检测到空间组装的小细胞肺癌群落

Para_01

1. CN分析提供了一种有效的策略来描述每个细胞周围局部微环境中的细胞组成。
2. 从空间上看，聚集或分散状态下的相同细胞类型在组织内可能表现出不同的生理功能。
3. 在这里，我们将那些聚集的同质细胞定义为细胞集落，以便更好地从细胞群体的角度研究空间相互作用。
4. 因此，我们开发了ColonyMap，一种空间集落检测算法，用于分析CODEX和SMI CosMx数据。
5. 如图4A所示，首先使用图像分割和轮廓识别算法（参见STAR方法）描绘出每个集落及其边界。
6. 然后，将不同集落的重叠区域确定为集落-集落相互作用（CCI）区域，并进一步进行分析。

图片说明

◉ 图4。ColonyMap检测到的小细胞肺癌的空间组装菌落。（A）ColonyMap算法的示意图。原始图像（左），算法识别的菌落和同种细胞边界（中），以及算法提取的边界和交互区域（右）。（B）ColonyMap检测到的肿瘤和免疫边界、TLS样结构和血管。苏木精和伊红染色和CODEX图像显示了标记应用后的组织染色。ColonyMap识别细胞菌落的边界。TLS样区域定义为T细胞菌落包围B细胞菌落的区域。（C）17个细胞菌落中几种免疫检查点和功能标志物表达的热图。（D）所有细胞亚群的UMAP，以及来自先前发表的人类小细胞肺癌scRNA-seq图集48中的SLFN11基因的标准化表达。（E）两两比较（D中标注的高vs低SLFN11表达的肿瘤细胞）基因集分析，使用对应于小细胞肺癌神经内分泌去分化、干扰素反应和免疫检查点的基因特征。（F）瀑布图，显示六个CCI类别在每个单个小细胞肺癌和混合型小细胞肺癌主要亚型中的分布。（G）ASCL1+肿瘤菌落靠近血管定位的菌落可视化。（H）每种类型的TC菌落内部或外部的EC比例。EC的比例计算为内部/外部EC数量除以核心中EC的总数。（I）根据面积比例[（ASCL1+ TCs∩ECs）/ECs]的复发无生存期Kaplan-Meier曲线。患者根据中位比例分为两组。另见图S7和表S1。

Para_01

1. 在我们的小细胞肺癌队列中，ColonyMap 准确地检测到了肿瘤和免疫边界，与苏木精和伊红（H&E）染色图像以及CODEX图像相比（图4B）。
2. 三级淋巴样结构（TLS）样的结构和血管也被成功描绘出来（图4B和S7A）。
3. 进一步比较ColonyMap和常用的多层感知器人工神经网络模型（ANN-MLP）表明了ColonyMap的可靠性（图S7B）。
4. 从CODEX数据中检测到了17种类型的细胞群。
5. 为了量化各种细胞群的空间分布，引入了Clark-Evans指数来评估每个患者的聚集程度。
6. Clark-Evans指数通常用于生态学中，用来量化给定区域内生物实体的空间聚集/分散程度。
7. 指数的分布和细胞群面积被绘制到核密度估计（KDE）图中，用于核心区域。
8. 免疫细胞群倾向于比TC细胞群聚集得更小（图S7C，表S1）。

Para_02

1. 我们首先探讨了每个菌落中的免疫检查点和功能标志物状态（图4C）。
2. DLL3 和 Bcl2 主要在 ASCL1+ 肿瘤细胞（TC）中表达，
3. 而 SLFN11 在 NEUROD1+ 肿瘤细胞（TC）和 MPTC 中高表达，这与 CN 结果一致。
4. 有趣的是，SLFN11 也在各种免疫细胞中表达，例如 CD8+ T 细胞，在单细胞数据中得到了证实（图4D）。
5. 据报道，SLFN11 还是一种模式识别受体，可以显著调节微环境的免疫特性。
6. 通路富集分析表明，TCs 中高表达的 SLFN11 激活了诸如 MYC 和 JAK-STAT 等信号通路以及检查点（图4E 和 S7D 和 S7E），这些已经被 Lauren 等人报道过。
7. 此外，生存分析显示，T 细胞中高表达的 SLFN11 可以预测较差的预后，优于免疫检查点的预测结果（图S7F）。

Para_03

1. 随后调查了不同小细胞肺癌亚型之间的菌落相互作用。
2. 为了概述，将不同菌落类型之间的CCIs（共同培养相互作用）分为六类：免疫-免疫、免疫-肿瘤、免疫-血管、肿瘤-肿瘤、肿瘤-血管和无相互作用（图4F）。
3. SCLC-A和混合SCLC-A显示比其他亚型更多的肿瘤-肿瘤CCIs，表明它们具有更大的肿瘤内多样性和空间复杂性。
4. 而免疫-免疫CCIs在SCLC-Y中更为常见，与高免疫浸润一致（图4F和S7G）。
5. 令人惊讶的是，发现ASCL1+肿瘤菌落主要定位在血管附近（图4G和S7H），ASCL1+菌落内的内皮细胞比例最高，与其他菌落相比（图4H）。
6. 更重要的是，在所有小细胞肺癌患者中，ASCL1+肿瘤菌落和内皮细胞菌落之间较低比例的CCI与更好的无复发生存期（RFS）（p = 0.0045）和总生存期（OS）（p = 0.022）显著相关（图4I和S7I）。
7. 据报道，增强的肿瘤-血管相互作用与较短的患者生存期有关，考虑到新形成的血管可以为肿瘤生长提供必要的营养，同时也可以作为远处扩散和转移灶建立的通道。

Para_04

1. 在小细胞肺癌中，肿瘤细胞和免疫细胞在肿瘤微环境中展示了不同的空间组织。
2. 在这里，我们的ColonyMap算法基于CODEX数据检测了细胞集落和集落相互作用。
3. 这种细胞集落和CCI分析可能为发现微环境中的临床上相关的亚结构提供了新的方法和视角。

CCI analysis identified survival-favorable MT2 niche

CCI分析确定了有利于生存的MT2生态位

Para_01

1. 免疫-免疫相互作用在TIME中起着至关重要的作用，然而，SCLC中的免疫相互作用尚未从空间单细胞的角度进行系统研究。这里，我们特别关注了与临床结果相关的免疫-免疫CCIs。
2. 首先，我们分析了免疫CCI的前五种相互作用的细胞类型（图5A）。
3. T细胞与其他免疫细胞表现出广泛的相互作用。
4. 在CCI面积方面，观察到T细胞和巨噬细胞之间的相互作用最为丰富。
5. 值得注意的是，DC和T细胞之间的CCI很少被检测到，这在一定程度上与DC的低丰度有关（图2）。

图片说明

◉ 图5。CCI分析确定了生存有利的MT2生态位。◉ (A) T细胞相关CCI区域与所有免疫-免疫CCI区域的比例。◉ (B) 免疫CCI中的详细细胞类型。在右上角的面板中，每个圆圈代表区域(Y ∩ X)与所有免疫-免疫相互作用区域的总和之比。在左下角的面板中，(Y ∩ X)的面积分别在每个核心内单独计算。根据区域(Y ∩ X)与细胞类型Y面积之比将核心分为三个交互水平：>50%，20%-50%，小于20%。最后，使用饼图表示不同交互水平的核心占所有核心的比例。虚线框内的区域表示巨噬细胞在核心和所有免疫-免疫CCI层面与各种T细胞类型紧密互动的区域。◉ (C) 预后相关的CCI网络。每个节点代表一种细胞类型，每条边代表两种细胞类型之间的CCI，这种CCI可以显著区分预后（p < 0.05）。红色/黑色边代表有利/不良预后。患者根据CCI比例（虚线）或CCI面积（实线）进行分组，其中位数作为分界点。分组后进行Kaplan-Meier分析。节点直径随着连接边的数量增加。◉ (D和E) 根据MT2生态位丰度的Kaplan-Meier曲线。(D) 和 (E) 根据MT2生态位和总体免疫浸润的组合进行Kaplan-Meier曲线。◉ (F) 典型MT2生态位富集/缺乏核心的代表性掩膜图像。橙色阴影区域表示MT2生态位。患者的生存时间（从左到右）：40.4个月，120.0个月，9.07个月，5.97个月。患者的生存状态（从左到右）：生存，生存，死亡，死亡。◉ (G) 使用CosMx测序数据注释的SCLC巨噬细胞亚群的UMAP降维。炎/IFN-巨噬细胞，炎症/干扰素诱导的巨噬细胞。LA/纤维化-巨噬细胞，脂质相关/纤维化巨噬细胞。增殖-巨噬细胞，增殖性巨噬细胞。◉ (H) 显示纤维化相关基因特征评分的SCLC巨噬细胞UMAP。48,53。◉ (I和J) 巨噬细胞脂质生物合成的标准化途径富集分数(I) 以及MT2生态位内外耗竭T细胞与有效T细胞比率(J)。配对t检验。所有样本均在CosMx验证样本的核心层面上。◉ Exh，耗竭；Eff，有效。◉ (K) 与MT2生态位内的巨噬细胞相关的KEGG通路的相关性GSEA图。参见图S8、表S1和表S4。

Para_01

1. 接下来，根据详细的10种免疫细胞类型重新检查了免疫CCIs。图5B（右上角面板）展示了特定CCI区域与总体免疫CCI区域的比例。
2. 如虚线框所示，巨噬细胞普遍与T细胞表现出丰富的相互作用（图5B；表S4）。
3. 为了测试这是否在核心样本中普遍存在，用不同颜色表示了不同核心中详细CCI的流行程度比例（图5B左下角面板）。
4. 结果显示，巨噬细胞相关的CCI确实在大多数核心样本中普遍存在（该CCI的比例>20%）。上述结果表明，在小细胞肺癌的肿瘤免疫微环境中，巨噬细胞和T细胞发挥着重要作用。

Para_02

1. 我们进一步探索了患者层面的详细CCIs，并将其与长期生存率相关联。与免疫相关的CNs不同，各种CCIs显示出了显著的预后关联。
2. 为了识别潜在的关键参与者，扫描了所有二元CCIs，包括六种TCs、10种免疫细胞和ECs。
3. 如果它们能够显著区分患者的预后，则被选中，并用于构建一个考虑CCI面积和比例的预后相关CCI网络（图5C）。
4. 在这个网络中，明显注意到一个有利于预后的菌落亚网络，其中包括巨噬细胞、NKT、CD8+ T细胞和Treg细胞。
5. 由于Treg细胞的比例较低（占总细胞数不到1%；表S1），我们最终关注了由巨噬细胞、NKT和CD8+ T细胞组成的免疫微环境（以下简称MT2）。
6. 令人震惊的是，发现高面积的MT2微环境与有利的长期生存率显著相关（p = 0.0049；图5D）。
7. 高水平/低水平的免疫浸润未能区分患者的预后（图S8A）。
8. 然而，无论总体免疫浸润情况如何，MT2面积似乎是一个独立的预后因素（图5E）。
9. 此外，在病理学N0患者中，MT2保持了其预后作用，但在N1-2患者中则没有（图S8B）。
10. 然后可视化了MT2微环境的空间分布。
11. 有趣的是，MT2微环境倾向于聚集在肿瘤菌落的边界处。
12. 这一现象在MT2微环境丰富的核心区域尤为明显，如图5F（上部面板）所示。
13. 相应地，报告了MT2微环境丰富的患者的OS从40到120个月不等（图5F上部面板）。
14. 相比之下，图5F（下部面板）显示了充满但分散的巨噬细胞和T细胞的核心区域，而不是聚集的MT2微环境。
15. MT2缺乏患者的相应OS范围从6到9个月（图5F下部面板）。

Para_03

1. 为了调查组装和分散状态的差异，我们随后检查并比较了巨噬细胞和T细胞在MT2生态位内外的功能标记物表达。
2. 生态位内的巨噬细胞表现出更高的CD11c，表明它们的抗原呈递能力增强，与外部的相比（图S8C）。
3. 同时，在MT2生态位内部观察到CD8+ T细胞上的免疫检查点标志物显著下降，如PD-1和CTLA4（图S8C），这表明MT2生态位内T细胞衰竭和免疫抑制减少。
4. 接下来，我们根据MT2生态位丰度（高低）对患者级别的bulk RNA测序数据进行了比较，并进行了基因集富集分析（GSEA）。
5. 结果发现，MT2高组中高度表达的基因主要富集于巨噬细胞激活、M1/M2巨噬细胞极化以及改善淋巴细胞趋化功能，部分解释了为什么MT2区域与良好预后相关（图S8D）。

Para_04

1. 进一步地，基于CosMx图像检测到的ColonyMap识别的MT2生态位证实了其在小细胞肺癌中的预后价值（图S8E）。
2. CosMx数据使我们能够探索MT2生态位内的详细细胞亚群和功能状态，我们采用了一种巨噬细胞亚群的共识模型，将巨噬细胞分类为增殖型（Prolif-Macro）、脂质相关/促纤维化型（LA/促纤维化-Macro）以及M1样炎症/干扰素诱导型（炎性/IFN-Macro）亚群（图5G）。
3. LA/促纤维化-Macro被认为是免疫抑制和促纤维化的，并且具有与特发性肺纤维化（IPF）相关的促纤维化特征（图5H和图S8F）。
4. MT2内外巨噬细胞和T细胞亚群的比例没有显著差异（图S8G），但明显的功能状态差异是存在的。
5. MT2内的巨噬细胞表现出低脂质合成、低缺氧和增强的抗原呈递能力（APC）（图5I和图S8H）。
6. 此外，MT2内的耗竭T细胞指数显著降低（图5J）。
7. MT2内的巨噬细胞显著富集了涉及T细胞激活和细胞毒性能力的信号通路（图5K）。

Para_05

1. 在这部分中，使用ColonyMap系统地进行了CCI分析。
2. 发现了一个有趣的免疫活跃的MT2生态位，该生态位由抗原呈递巨噬细胞与激活的细胞毒性T细胞和NKT细胞组成，并且与小细胞肺癌中的总体"免疫沙漠"无关，与良好的生存率相关。
3. 这些免疫细胞的独特功能状态表明小细胞肺癌内部存在独特的局部肿瘤微环境，暗示MT2生态位可能影响免疫治疗反应。

M1-like macrophage-based MT2 niche predicted ICB response

基于M1样巨噬细胞的MT2生态位预测ICB反应

Para_01

1. 此前，TIME经常被报道与预后不仅相关，还与免疫治疗的反应和疗效有关。
2. 诸如scRNA测序等技术极大地促进了对免疫细胞亚群和免疫治疗反应机制的研究。
3. 在SCLC中，ICB的结果在患者之间表现出异质性。
4. 迫切需要探索稳健的免疫标志物，以帮助对SCLC患者进行分层并预测ICB反应。

Para_02

1. 我们随后收集了一个独立的队列，包括23名接受抗PD-L1免疫治疗（阿特珠单抗或度伐利尤单抗）的广泛期小细胞肺癌（ES-SCLC）患者。
2. 样本通过组织活检在ICB治疗前获得，并且我们对肿瘤切片进行了多重免疫荧光（mIF）和CosMx分析，用于空间映射和集落分析（图6A）。
3. 患者被分为持久临床获益（DCB）组和无持久获益（NDB）组，由医生进行临床评估。
4. 此外，治疗后的长期生存情况也被选作ICB疗效评价的一部分。
5. 该队列的详细临床病理特征见表S1。
6. 最长随访时间为33.93个月。
7. 八名患者在接受ICB治疗后达到了持久临床获益，而十五名患者未达到持久临床获益。

图片说明

◉ 图6。基于M1型巨噬细胞的MT2生态位预测ICB反应（A和B）收集接受抗PD-L1免疫治疗的广泛期小细胞肺癌（ES-SCLC）患者（A）以及基于多重免疫荧光（mIF）图像的集落检测（B）。组织切片使用针对PanCK、CD3、CD8、CD56、CD68和CD86的抗体进行染色。（C）DCB和NDB患者之间肿瘤细胞（TC）和免疫细胞集落面积的比较。整个载玻片组织面积用于标准化。Wilcoxon检验。临床获益由医生根据实体瘤（RECIST）v1.1中的反应评估标准进行评估。（D）DCB和NDB患者在低和高M1 MT2丰度组之间的分布。Fisher精确检验。（E）根据M1 MT2生态位丰度的总体生存Kaplan-Meier曲线。（F-H）基于SMI CosMx测序的17名有可用样本的ES-SCLC患者中MT2生态位的识别。（F）DCB和NDB患者在MT2生态位内或之外的Inflam/IFN-Macro和CD8+ Texh频率的比较。∗p < 0.5的t检验。（G）显示DCB和NDB患者Prolif-Macro和CD8+ Texh中SLFN11表达的箱线图。Wilcoxon检验。（H）区分SCLC免疫治疗反应的预测因素的AUC值。另见图S8、表S1和表S2。

Para_02

1. 我们使用了六种免疫细胞谱系标志物，包括CD86，以区分mIF测试中的M1样炎性巨噬细胞。
2. 结果显示，在mIF图像上成功识别了不同的细胞群和MT2生态位，证明了ColonyMap方法的强大（图6B）。
3. DCB组和NDB组之间的免疫细胞群比例或MT2区域没有显著差异（图6C和S8I）。
4. 然而，当患者进一步被划分为高M1-MT2组和低M1-MT2组（由M1样CD86+巨噬细胞、CD8+ T细胞和NKT细胞组成）时，注意到高组中的DCB患者数量高于低组（p = 0.089；图6D）。
5. 重要的是，预后分析显示，高M1-MT2比例与免疫治疗后的生存期延长显著相关（图6E）。
6. 相比之下，总MT2区域的比例未能预测ICB结果（图S8J）。

Para_03

1. 基于来自ES-SCLC队列的CosMx数据，MT2的细胞组成与免疫治疗的效果相关（图6F和S8K、S8L）。
2. 在MT2微环境中，DCB组中M1样炎/IFN-巨噬的比例显著高于NDB组，验证了mIF的结果。
3. 然而，NDB组中增殖性巨噬细胞和衰竭的CD8+ T细胞的数量显著增加。
4. 这可能与SLFN11的高表达有关（图6G）。
5. 最后，我们分析了上述标志物以及先前报道的与ICB反应相关的ASCL1+YAP1+免疫热肿瘤簇56，发现MT2内部炎/IFN-巨噬的比例和增殖性巨噬细胞中的SLFN11表达对预测临床疗效表现出较高的性能（图6H）。

Para_04

1. 巨噬细胞被认为是肿瘤微环境内功能异质的。
2. 特定的巨噬细胞亚群已被证明可以与其他免疫细胞如CD8+ T细胞相互作用，并在不同癌症中增强抗肿瘤免疫力。
3. 我们的研究首次检测到一个稳定的抗肿瘤微环境，其中包括M1型样巨噬细胞、CD8+ T细胞和NKT细胞，这可能很好地预测了小细胞肺癌（SCLC）对免疫检查点阻断（ICB）治疗的反应，从而为基于时间的小细胞肺癌免疫疗法铺平了道路。
4. 57,58

Discussion

Para_01

1. 多维成像技术能够捕获FFPE组织中的空间地理信息，并且具有长期随访数据，补充了SCLC中生存与空间细胞分析之间的宝贵研究。
2. 在这里，我们系统地为165名具有长期随访的SCLC患者生成了宝贵的CODEX和多组学数据，基于这些数据，我们报告了单细胞水平上肿瘤内异质性和免疫微环境的空间组织。
3. 更重要的是，我们提出的ColonyMap算法揭示了一种空间聚集的免疫龛（MT2），其特征在于预测免疫治疗反应和指导分层治疗策略的预后和预测潜力。

Para_02

1. SCLC 表型异质性越来越受到认可，界定 SCLC 亚型代表了精准医学的第一步。
2. 除了四种 SCLC 亚型外，单细胞分辨率成像在本研究中超过 10% 的 TCs 中发现了 MPTCs。
3. 邻域分析使我们能够将这些 MPTCs 可视化为 SCLC-A 亚型内的独特空间模式。
4. 中心邻域（CN9）的特点是高度增殖的 TCs 共表达 ASCL1 和 NEUROD1 或 YAP1。
5. 这些观察结果与新兴证据一致，表明 SCLC 在不同的分子亚型之间表现出可塑性，可能起源于共同的 NE 前体细胞，该细胞可以沿着不同轨迹去分化。
6. 这表明大规模测序只能捕获最丰富的状态。
7. 值得注意的是，我们的结果显示，即使 SCLC-A 中 MPTCs 的一小部分也赋予了较差的预后，这可能归因于它们的上皮间质转化（EMT）表型。
8. EMT 引发了细胞间黏附的缺乏和迁移能力以及治疗抗性的增强，这在 SCLC 发病机制中越来越被提及。
9. RBBP6 突变与 CN9 结构之间的关联可能介导了 SCLC 中的 EMT 并促进了转移扩散。
10. 此外，CN9 内的 MPTCs 以及 CN10 内的 NEUROD1+ TCs 显示出更高的 SLFN11 表达，SLFN11 是一种潜在的 PARP 抑制剂靶点，也是干扰素刺激基因。
11. TCs 和炎性细胞因子的持续刺激诱导免疫细胞尤其是 T 细胞中的高 SLFN11 表达，进一步导致功能耗竭和免疫反应受损。
12. 尽管增强了 SCLC-N 亚型中某些 T 细胞的空间相互作用（图 S5H），SLFN11 的高表达可能会逐步重塑免疫微环境，并最终导致免疫抑制，这与之前的报告一致。
13. 这些数据表明，细胞起源、基因组改变和肿瘤细胞进化动态进一步塑造了 SCLC 亚型异质性。

Para_03

1. 此外，在生物界中，同种生物形成群体的现象非常普遍。
2. 这些群体通过信息交换协调集体行动，共享资源，并增强个体的适应性和抵抗力。
3. 生态学研究长期以来一直在揭示物种群体中的空间模式。
4. 然而，细胞群体的视角尚未应用于空间组学分析，尽管最近的研究报告称这些区域与各种生理功能和患者的预后有关。
5. 我们提出的ColonyMap算法在研究细胞聚集模式、群体边界以及群体相互作用区域方面具有独特的优势。
6. 从技术上讲，分子和细胞肿瘤分析代表了微观尺度的调查，而肿瘤和器官病理分析则代表了宏观尺度的研究。
7. 我们的基于ColonyMap的细胞群体和CCI分析可以被视为对肿瘤内部结构组织的中尺度研究。

Para_04

1. 值得注意的是，ColonyMap 还可以扩展到额外的空间组学分析。
2. 空间转录组学（ST）和空间蛋白质组学（SP）的独特数据特征促使了专门的分析方法的发展，以研究细胞间通讯（CCC）。
3. 传统的 CCC 分析如 CellChat 和 CellPhoneDB 基于整合的受体-配体相互作用数据来计算细胞间通讯权重和模式，提供了强大的结果解释性。
4. 它们主要依赖检测到的基因面板，使得它们不适合技术含量有限的标记技术。
5. 另一方面，ColonyMap 算法依赖于细胞类型注释及其空间分布模式，使其能够扩展到多种空间平台。
6. 同时，ColonyMap 排除了离散细胞，有益地消除了细胞间异质性的影响。
7. 需要注意的是，仅靠 ColonyMap 无法阐明殖民地交互背后的分子机制，还需要进一步的基因表达和通路分析。

Para_05

1. 通过ColonyMap，我们确定了抗肿瘤MT2生态位的空间分布，并揭示了其对SCLC预后的积极影响。
2. 巨噬细胞在肿瘤微环境中扮演双重角色，54,66因为它们可以识别、结合和吞噬肿瘤细胞，67,68但往往无法做到这一点，甚至可能促进肿瘤生长和转移。69,70
3. 越来越多的证据表明，巨噬细胞-T细胞之间的交流在塑造抗肿瘤免疫和免疫治疗效果方面起着关键作用。71,72
4. 浸润到肿瘤中的巨噬细胞可以通过抗原呈递、细胞因子分泌和共刺激信号促进T细胞招募、激活和效应功能。
5. 相反，最近的研究报告称，活化的T细胞能够通过CCR5信号吸引巨噬细胞进入其附近，并诱导巨噬细胞向抗肿瘤M1样表型极化。73
6. ColonyMap算法首次确认了SCLC患者中具有有利预后患者的细胞毒性T细胞和巨噬细胞的空间组装。
7. 从空间上来看，这些MT2生态位通常出现在肿瘤-基质边界处，准备发挥潜在的抗肿瘤活性。
8. 功能上，MT2中的巨噬细胞表现出促炎性和高抗原呈递表型，而T细胞则显示出较少的耗竭状态，这表明MT2组装可能比分散的免疫细胞类型更能增强抗肿瘤能力。
9. 除了与抗肿瘤免疫和患者预后相关外，我们进一步描述了ES-SCLC队列中MT2生态位内巨噬细胞的功能状态，旨在识别与治疗反应相关的免疫空间结构。
10. 我们的结果显示，由促炎性M1样巨噬细胞组成的MT2生态位与活跃的免疫反应密切相关。
11. 研究表明，肿瘤内的多细胞结构如CD4+CD8+APC在免疫治疗效果中起着关键作用。74
12. 在小鼠模型中发现，特定的多重免疫细胞激活抗体（如DC-T细胞激活剂）具有比标准疗法更强的抗肿瘤免疫能力。75
13. 因此，MT2生态位可能还可用作SCLC临床试验指定的有效生物标志物，以及指导开发特定的免疫抗体来诱导SCLC患者的免疫反应。

Para_06

1. 总的来说，我们提供了迄今为止已知的第一个包含SCLC中CODEX和多组学信息的空间解析数据集。
2. 虽然以前的组学研究集中在小细胞肺癌（SCLC）的分子和细胞分析上，但我们的高维图像和开发的ColonyMap揭示了肿瘤、血管和免疫细胞群在空间上的相互作用，以及免疫结构微环境如何与临床结果相关联。
3. 鉴于SCLC患者有限的治疗选择以及对免疫治疗反应的异质性，探索特定的免疫细胞相互作用，例如M1-MT2微环境，是否可以作为SCLC患者的预后和预测因素具有未开发的转化价值。
4. 此外，随着推进治疗策略的临床试验进展，我们的方法可能有助于制定可靠的SCLC患者分层指南，以提高治疗反应。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_07

1. 我们的研究提供了前所未有的小细胞肺癌的空间图谱资源，并揭示了其分子异质性以及关键的免疫架构，但仍存在一些局限性需要进一步调查。
2. 首先，我们的分析集中在可切除的局限期和未经治疗的小细胞肺癌上。
3. 然而，目前尚不清楚本研究中观察到的空间模式和细胞相互作用是否适用于转移性肿瘤或接受治疗药物的患者。
4. 未来的研究需要纳入更广泛范围的小细胞肺癌阶段和状态，这将至关重要，以便全面阐明这种恶性肿瘤内的空间异质性的程度。
5. 其次，我们进行的空间分析基于从肿瘤组织核心构建的TMA（组织微阵列），其中单个核心的TIME特性可能无法完全代表肿瘤的整体景观，因为存在肿瘤内异质性。
6. 为了解决这个问题，我们选择了直径为2毫米的核心，并且大多数肿瘤包括两个或更多的核心，从而在实现高通量分析的同时确保代表性采样。
7. 最后，虽然我们的研究识别出了潜在的预后和预测的空间生物标志物，但它们的临床效用仍需在前瞻性临床试验中得到验证。
8. 此外，开发标准化的分析流程和稳健的空间度量将是把这些发现转化为临床实践并促进其与其他分子和临床数据整合所必需的。

Resource availability

Lead contact

主要联系人

Para_01

1. 进一步的信息和资源及试剂的需求应联系相应作者和主要联系人Zhiwei Cao（zwcao@fudan.edu.cn），并将由其提供满足。
2. ,

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究没有产生新的独特试剂。

Data and code availability

数据和代码可用性

• WES和RNA测序的原始数据已提交至中国国家生物信息中心/北京基因组研究所（中国科学院）的基因组序列归档数据库（GSA数据库：WES的数据编号为HRA007321，RNA测序的数据编号为HRA007339）。
• 本手稿中使用的分析代码可在https://github.com/wangjun-hub/CODEX_SCLC获取。
• 样本注释、处理和标准化的数据文件在表 S1 中提供。
• 处理过的初级成像数据可以从Zenodo获取：https://zenodo.org/records/11115430。
• 本文报道的原始成像数据和任何重新分析所需附加信息可在请求时从主要联系人处获得。

Acknowledgments

Para_01

1. 这项研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFA1103900和2023YFC3404000），国家自然科学基金（82430099、81930073、32070657、82373309和82102914）的支持。
2. 此外，还得到了徐汇区重大疾病攻关项目（XHLHGG202101）、上海市卫生健康委员会（2020CXJQ02）、上海市抗癌协会（SACA-AX202210）和北京生命绿洲公共服务中心（CPHCF-ZLKY-2023016）的支持。
3. 我们要感谢阮英刚、王菲菲、张少乾和陈燕华在技术上的出色协助。
4. 顾燕子在创建组织芯片（TMA）方面提供了帮助。
5. 王俊和高健在开发ColonyMap算法方面提供了帮助。
6. SMI CosMx测序由位于广东省深圳市的裕测生物科技有限公司完成。
7. 本研究中的计算是在复旦大学CFFF平台上进行的。
8. 一些图表是由BioRender.com创建的。

Author contributions

Para_01

1. 概念化，H.C.，C.D.，Y.Z.和Z.C.；方法论，J.G.，俊W.，Q.W.，M.Z.，S.Z.，B.Y.，Q.H.和Y.H；验证，Y.W.和F.傅；正式分析，H.C.，C.D.和J.G.；调查，H.C.，C.D.，J.G.，俊W.，F.范，K.L.，Y.Z.和Z.C.；资源，H.C.，C.D.，H.H.，Y.L.，Y.Z.和Z.C.；数据整理，H.C.，C.D.，J.G.，俊W.，X.S.，Q.Z.和Z.C.；撰写-原始草稿，H.C.，C.D.，J.G.和俊W.；撰写-审查与编辑，H.C.，C.D.，J.G.，嘉W.，Y.Z.和Z.C.；可视化，C.D.，J.G.，金W.，T.H.，C.Z.，F.Y.和B.Y.；监督，H.C.，C.D.，Y.Z.和Z.C.；资金获取，H.C.，Y.Z.，嘉W.，Y.L.和Z.C.

Declaration of interests

Para_01

1. J.W., T.H., 和 C.Z. 是厦门艾德生物有限公司的员工。
2. F.Y. 是强生中国研发公司的员工。

STAR★Methods

Key resources table

关键资源表

Experimental model and subject details

实验模型和受试者详情

Patient cohorts

患者队列

Para_01

1. 我们利用了复旦大学人类肺组织多组学图谱（HLTMA）中前瞻性收集的有限阶段手术切除的小细胞肺癌患者队列。
2. 该队列包括2010年至2021年间诊断出的165名主要手术切除的小细胞肺癌患者，有可用于免疫组化（n = 144）、CODEX（n = 129）、bulk RNA测序（n = 109）、全外显子组测序（n = 87）和SMI CosMx（n = 50）的组织。
3. 另一个广泛阶段接受免疫治疗的小细胞肺癌队列（n = 23），他们接受了PD-L1阻断联合化疗（阿特珠单抗每三周1200毫克或度伐利尤单抗每三周1500毫克），被收集用于多重免疫荧光（mIF）和CosMx验证及探索免疫治疗反应预测。
4. 本研究获得了复旦大学上海肿瘤医院机构审查委员会（IRB#2111246-9）的批准，并且所有参与患者的书面知情同意书均已获得。
5. 两个队列的临床病理信息见表S1。

Cell lines

细胞系

Para_01

1. 人类H69细胞由复旦大学张志文教授慷慨提供。
2. 所有的人类小细胞肺癌细胞均使用含有10%胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基进行培养。

Animals

动物

Para_01

1. 四周龄雄性BALB/c裸鼠购自LC公司（中国上海），用于建立肺原位小细胞肺癌细胞系模型。
2. 我们使用优化的环境饲养这些小鼠，包括12小时光照/12小时黑暗循环，温度保持在20°C至23°C之间，湿度保持在40%至60%，并提供标准饲料和水。
3. 所有动物实验均遵循复旦大学附属肿瘤医院机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。

Method details

方法细节

Construction of tissue microarray

组织微阵列的构建

Para_01

1. 胸腔病理学家(Q.Z.)在苏木精和伊红染色的切片上识别了适合染色的癌变区域。并通过对标记区域进行切除和处理，制备了含有251个2.0毫米肿瘤核心的组织微阵列（TMA）块。另外从配对的正常组织块中提取了16个相邻正常区域的核心。在这129个纳入分析的肿瘤中，118个由两个核心表示，九个由一个核心表示，两个由三个核心表示。当肿瘤由多于一个核心表示时，使用所有核心的数据来计算每个患者的细胞数量和细胞表型比例。我们使用由两个核心表示的肿瘤子集来评估空间内的肿瘤间异质性（图S2）。将TMA切片的切片放置到载玻片上用于CODEX、CosMx和苏木精-伊红染色。
2. Sections of TMA slides were cut onto glass slides for CODEX, CosMx and H&E staining.

CODEX antibody conjugation and panel creation

CODEX抗体偶联和面板创建

Para_01

1. 根据先前描述的CODEX染色和成像协议进行了CODEX多重成像。
2. 抗体面板经过精心策划，包括识别肿瘤、基质、先天性和适应性免疫细胞亚型以及细胞功能标志物的目标（表S2）。
3. 每种抗体都与一个独特的寡核苷酸条形码结合，并用这些抗体-寡核苷酸结合物对组织进行染色。
4. 染色模式通过与已建立的免疫组化谱在阳性对照肠或扁桃体组织中的比较得到了验证。
5. 同时，H&E形态学染色确认了标记表达的定位。
6. 在多重CODEX循环之前，抗体-寡核苷酸结合物经历了低复杂度荧光测定，以评估信噪比并优化染色条件。
7. 随后，在单一且高度多重化的CODEX实验中使用了整个经过验证的抗体面板。

CODEX multiplexed imaging

CODEX多重成像

Para_01

1. 在验证了精心制备的抗体-寡核苷酸偶联物面板后，我们在组织阵列上进行了多路复用的CODEX成像。
2. 这一循环过程包括连续的剥离、退火和荧光标记的寡核苷酸的成像，这些寡核苷酸与偶联物上的寡核苷酸条形码互补。
3. 在全规模CODEX多路复用之前，进行了一次测试运行，以进一步优化信噪比、抗体稀释度、曝光时间和每种偶联物的适当循环。
4. 最终，组织阵列经历了全面的多路复用CODEX成像，每次运行的元数据如表S1所示。

SMI CosMx sequencing

SMI CosMx 测序

Para_01

1. Spatial分子成像（SMI）CosMx测序技术代表了一种强大的方法，可以在亚细胞分辨率下进行原位转录组学和蛋白质组学分析。
2. 这种无酶、无需扩增的基于杂交的单分子条形码方法能够直接检测标准病理玻片上的完整FFPE样本。
3. SMI方法采用两种组分探针设计，包括一个目标结合域和一个读出域。
4. 目标结合域是一个35到50个核苷酸的序列，能够与感兴趣的靶RNA杂交。
5. 而读出域包含四个连续的10到20个核苷酸的报告物着陆序列。
6. 这些着陆序列随后与荧光标记的分支报告物杂交，通过四个荧光通道的组合信号实现64位条形码方案。

Para_02

1. SMI CosMx 测序工作流程包括标准的组织制备，随后是探针杂交和在与 SMI 仪器集成的流式细胞中的循环报告读出。
2. 值得注意的是，我们的实现利用了一个包含 6,000 个目标的基因面板，从而实现了全面的转录组分析。
3. 在每次报告器杂交和成像之后，紫外线裂解步骤有效地淬灭了荧光信号，使得可以进行后续的与下一轮报告器的孵育。

Genomics and transcriptomics profiling

基因组学和转录组学分析

Para_01

1. 总DNA使用QIAamp DNA组织试剂盒（QIAGEN）根据制造商的协议从组织中提取。
2. 为了构建测序文库，使用了Covaris M220聚焦超声波破碎仪对DNA进行片段化。
3. 然后，根据供应商的协议，使用Human Exome 2.0 Plus（Twist Bioscience）捕获外显子组。
4. 最终含有150 bp双端读取的DNA文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行了测序。

Para_02

1. Total RNA 使用 AmoyDx RNA kit（Amoy 诊断）提取，并通过 Agilent Bioanalyzer 2100 系统（Agilent 技术）进行了质量检测。
2. 样品的 RNA 完整性编号（RIN）大于 7.0 被认为是高质量的。
3. 使用 Ribo-Zero gold rRNA 去除试剂盒（Illumina）从 5 微克总 RNA 中去除核糖体 RNA，
4. 随后将其片段化为短片段（NEBNext 镁 RNA 片段化模块）。
5. 最后，在 Illumina NovaSeq 6000 平台上按照制造商的协议进行了双端（2 x 150 bp）测序。

Immunohistochemistry

免疫组织化学

Para_01

1. TMAs和载玻片使用针对SCLC亚型定义标志物的ASCL1（Abcam），NEUROD1（Abcam），POU2F3（Santa Cruz）和YAP1（Santa Cruz）进行染色，采用Anti-mouse/rabbit免疫组织化学（IHC）检测试剂盒（Proteintech）根据制造商协议进行。
2. 两名独立的病理学家（Y.L.和Q.Z.）以盲法审查了染色的载玻片。
3. 对于基于IHC的SCLC样本分子分型，我们采用了常见的histscore（H-score，范围0-300）方法，该方法通过将标记阳性TCs的比例（0%-100%）乘以阳性染色强度（无染色= 0，弱染色= 1，中等染色= 2，强染色= 3）计算得出。
4. 最终肿瘤亚型根据亚型标志物中最高的H-score确定。

Multiplex immunofluorescence

多光谱免疫荧光

Para_01

1. FFPE整个组织切片使用针对细胞角蛋白（Absinbio）的抗体进行染色，CD3（Absinbio），CD8（Absinbio），CD56（Absinbio），CD68（Absinbio）和CD86（Absinbio）。所有抗体均按照TSA 7-color试剂盒（Absinbio）中的一个荧光团与之结合，遵循制造商的协议。
2. 切片由组织成像系统（Aperio Versa 8；Leica）扫描。

Animal experiments

动物实验

Para_01

1. 通过肺内注射在4周龄雄性裸鼠中建立了原位肺癌模型。
2. 小鼠用戊巴比妥钠（50毫克/千克）麻醉，并置于右侧卧位。
3. 在左侧胸部壁切开一个8-10毫米的口子后，暴露了胸膜腔，使左侧肺部得以可视化。
4. 准备了一种包含1×10^6个H69细胞的细胞悬液，这些细胞的存活率大于90%，该悬液由40微升PBS和40微克生长因子减少的Matrigel组成。
5. 该悬液通过胸膜直接接种到左肺实质中。
6. 注射后，手术部位被缝合，小鼠被置于左侧卧位以监测恢复情况，直至完全恢复。

Para_02

1. 四星期后，在原位肺肿瘤模型植入后，小鼠接受了多参数磁共振成像（MRI）以评估原发肿瘤的建立和转移扩散。
2. MRI 在一台7T小型动物MRI系统（Bruker BioSpin，马萨诸塞州比勒里卡）上进行，获取了大脑、肺部和腹部的T2加权图像。
3. 带有原位肺肿瘤的小鼠被安乐死，然后取出它们的肺，并根据已发表的方法采用酶消化方案。
4. 使用10x Genomics Chromium Next GEM单细胞3'v3.1平台进行了单细胞捕获、条形码标记和文库制备，操作步骤遵循制造商的说明。
5. 最终文库在Illumina NovaSeq 6000系统上进行测序，采用了150bp双端测序。

Quantification and statistical analysis

量化和统计分析

CODEX image processing and single-cell segmentation

CODEX图像处理和单细胞分割

Para_01

1. 完成CODEX和mIF染色实验后，每个原始QPTIFF图象被导入到QuPath（版本0.3.2）进行初步的质量控制，包括图像拼接、漂移补偿、去卷积和周期连接。
2. 出焦区域、组织折叠和碎片等伪影被手动注释并从分析中排除。
3. 进行了单个细胞分割以获得定量的单细胞信息。
4. 然后使用基于深度学习的算法StarDist对处理后的图象进行分割，利用其默认参数，并将模型应用于DAPI通道。
5. 为了增强预测的图象对比度，实施了预处理步骤，包括将图象大小减小50%以及应用对比度受限的自适应直方图均衡。
6. 随后使用x-y坐标确定每个细胞的质心。
7. 两位专业病理学家（Y.L. 和 Q.Z.）对分割进行了全面的定性评估，以确认分割过程的稳健性和可靠性。
8. 可以在https://github.com/qupath/qupath/releases和https://github.com/qupath/qupath-extension-stardist/releases下载QuPath软件和StarDist脚本。

Single-cell lineage assignment

单细胞谱系分配

Para_01

1. 然后使用分割掩模计算每个蛋白质标记的平均强度，并将其归一化到对象区域。
2. 由于高度多重化的成像存在表型挑战，我们基于规范谱系标记创建了一个细胞表型流程，并采用监督层次方法来分配细胞表型（图S1C）。
3. 考虑到仅使用阈值作为细胞表型的单一测量可能不足以生成可用的分类，我们选择了QuPath中的基于机器学习的细胞注释方法来训练图像分类器并执行细胞表型分析。
4. 这种方法允许在一个分类器内整合互斥标记（即谱系标记），并促进在重复图像集上的训练。
5. 通过根据荧光表达模式手动标注阳性细胞和阴性细胞（该过程由病理学家监督），模型整合了分类器之间的细胞表型，并将训练参数应用于整个图像。
6. 病理学家重新验证了细胞注释结果，通过增加训练数据集（对象数量）和调整训练细胞类型解决了不准确性。
7. 对于功能标记（如免疫检查点PD-1、PD-L1或潜在的小细胞肺癌目标DLL3、SLFN11）等谱系标记之外的标记，我们采用了相同的方法为每个标记训练单独的分类器。
8. 识别阳性细胞，并量化其在感兴趣的细胞群体中的比例，从而评估功能表型异质性。

Cell-cell pairwise interaction analysis

细胞之间的成对相互作用分析

Para_01

1. 我们进行了一次基于置换检验的单细胞配对交互分析，该分析检测了显示出比通过置换所有细胞标签得出的随机分布更强（"交互"）或更弱（"避免"）共定位的细胞表型对。
2. 统计显著性评分（交互：1；无显著性：0；避免：−1）被返回并归一化为Z分数以生成热图。

Cellular neighborhood identification and Voronoi diagram generation

细胞邻域识别和Voronoi图生成

Para_01

1. 为了进行邻域分析，我们首先捕获了所有图像和细胞表型中的"窗口"，这些窗口包含了基于细胞质心的最近的20个相邻细胞。
2. 随后，使用Python的scikit-learn实现的MiniBatchKMeans算法（k=20）对这些"窗口"进行了聚类，以根据细胞组成检测CNs。
3. 最后，使用Voronoi图将彩色CNs特别叠加在原始荧光图像上，并可以计算每个CN中的细胞表型比例。

t-distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)

t-分布随机邻嵌入(t-SNE)

Para_01

1. 所有t-SNE图均在Jupyter Notebook（版本1.0.0）中使用默认参数生成。
2. 用于t-SNE分析的标记包括CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIM3、VISTA、BCL2、BTK、DLL3、Ki67、SLFN11、p53、CD45RO和Vimentin。
3. 为了可视化，表达数据针对所有标记进行了标准化（图S6D）。

Uniform Manifold approximation and projection (UMAP)

均匀流形近似和投影（UMAP）

Para_01

1. 我们在这项研究中结合使用了UMAP和无监督聚类方法来注释来自公开可用的scRNA-seq数据以及SMI CosMx测序的单细胞。
2. 在使用UMAP进行降维后，我们进行了无监督聚类，将细胞划分成不同的亚群。
3. 利用基于图的算法和基于密度的方法，我们识别出转录上一致的簇，代表假定的细胞类型或状态。
4. 此外，我们利用Chan等人提供的公开参考数据集来促进稳健的注释。
5. 通过系统地比较基因表达特征，我们可以将我们的簇映射到已知的细胞群体，从而更深入地解释观察到的异质性。

Pseudotime trajectory analysis

伪时间轨迹分析

Para_01

1. Monocle2（版本2.30.0）被用于确定五个与TC相关的CN（CN2、CN3、CN9、CN13、CN17）的分化，这些CN具有潜在的发育关系。
2. 对于邻域分析，选择了五种谱系标记物（PanCK、ASCL1、NEUROD1、POU2F3、YAP1）来进行细胞排序。
3. DDRTree（版本0.1.5）在去除不同样本批次效应后被用来学习树状轨迹。

Correlation of cellular neighborhood with genomic features

细胞邻域与基因组特征的相关性

Para_01

1. CNs与拷贝数变异（CNAs）之间的关联分别针对获得和缺失进行了测试，基因突变也采用了类似的策略。
2. 我们对每个CN拟合了广义线性模型（在一个二项分布下使用logit链接函数），因变量是CN的比例。
3. 观察到少于三次突变的基因被排除在关联分析之外。
4. 与拷贝数状态相关的测试仅限于COSMIC数据库中标记为"扩增"或"大片段缺失"的基因，以及与免疫细胞溶解活性相关的基因。

Cell ColonyMap analysis

细胞集落图分析

• 每个细胞表型的区域和坐标集分别从核心中提取出来。
• (2)将每个细胞表型的空间分布和大小单独投影到一个空白层上。为了简化计算，每个细胞表型的大小统一设置为其类型中所有细胞的中位大小。
• 识别单个细胞集落的轮廓。详情参见"代码可用性"部分。
• 将所有单个细胞表型的轮廓集投影到单个图像上以便后续分析。为了量化细胞类型A和B之间的相互作用强度，设计了三种度量方法：

ColonyMap performance evaluation

ColonyMap 性能评估

Para_01

1. 为了评估ColonyMap的准确性，我们在随机选择的50个核心中测试了其在肿瘤边界识别方面的性能，并将病理学家手动标注的结果作为金标准。
2. ColonyMap与一个常用的多层感知器人工神经网络（ANN-MLP）模型进行了比较。
3. 用于后续指标计算的像素数是通过描绘轮廓内的像素来确定的。
4. 具体来说，真阳性（TP）被定义为测试方法和手动标注都识别出阳性区域的像素数量。
5. 类似地，我们计算了假阳性（FP）和假阴性（FN）。
6. 值得注意的是，由于背景画布大小的影响，真阴性被排除在进一步的计算之外。
7. 我们应用了广泛采用的模型评估指标进行比较，包括：灵敏度=TP/(TP+FN)
8. 精确率=TP/(TP+FP)
9. F1分数=2×精确率×灵敏度/(精确率+灵敏度)

Immunotherapy response evaluation

免疫治疗反应评估

Para_01

1. 根据实体瘤反应评估标准（RECIST）v1.1，对anti-PD-L1抗体（阿特珠单抗或度伐利尤单抗）产生完全缓解（CR）或部分缓解（PR）或疾病稳定（SD）持续时间超过24周的患者被认为是具有持久临床获益（DCB）。
2. 显示疾病进展（PD）或疾病稳定（SD）持续时间不超过24周的情况被认为是未显示出持久临床获益（NDB）。

Survival analysis

生存分析

Para_01

1. Log rank tests were used to assess OS or RFS differences between specific clinical status or among SCLC molecular subtypes。
2. 通过Logrank检验评估了特定临床状态之间的OS或RFS差异，或者小细胞肺癌分子亚型之间的OS或RFS差异。
3. Associations of cell-cell interaction or CN frequency with survival were conducted using Cox proportional-hazards regression models, adjusting for pathological TNM stages by including it as a covariate。
4. 使用Cox比例风险回归模型分析了细胞间相互作用或拷贝数频率与生存率之间的关联，并通过将其作为协变量包括在内来调整病理TNM分期。
5. During the calculation of immune infiltration, we first treated all immune cell types collectively as a single category.
6. 在计算免疫浸润的过程中，我们首先将所有免疫细胞类型作为一个单一类别来处理。
7. Then we used ColonyMap to calculate the area of all immune cell colonies to represent the intensity of immune infiltration.
8. 然后我们使用ColonyMap计算所有免疫细胞簇的面积来表示免疫浸润的程度。
9. The median value was used to stratify high/low immune infiltration to perform survival analysis.
10. 中位数值用于将高/低免疫浸润分层，进行生存分析。
11. OS was calculated from the date of treatment to date of death or last known follow-up.
12. OS是从治疗日期到死亡日期或最后一次已知随访日期的时间。
13. RFS was calculated from the date of treatment to date of recurrence or last known follow-up.
14. RFS是从治疗日期到复发日期或最后一次已知随访日期的时间。

Statistical analysis

统计分析

Para_01

1. 所有统计分析均使用 GraphPad Prism (9.0.0)、R (4.3.1) 或 Python (3.11.5) 进行。
2. 正态分布的数据通过双尾学生 t 检验在两个组之间进行比较。
3. 非正态分布的数据通过 Mann-Whitney 检验在两个组之间进行比较。
4. 多个组之间的比较使用 Kruskal-Wallis 检验。
5. 多重检验校正使用 Benjamini–Hochberg 检验。
6. 除非另有说明，p < 0.05 被认为是显著的。

Supplemental information

Para_01

1. 下载：下载 Acrobat PDF 文件（20MB）
2. 文档 S1。图 S1-S8。
3. 下载：下载电子表格（692KB）
4. 表 S1。与图 1、2、3、4、5 和图 6 相关的所有空间 SCLC 图集样本的元数据。
5. 下载：下载电子表格（12KB）
6. 表 S2。与图 1、图 2 和图 6 相关的 CODEX、mIF 和 IHC 面板及抗体。
7. 下载：下载电子表格（12KB）
8. 表 S3。根据 SCLC 主要亚型分层的 CNs 的 Cox 回归分析，与图 3 相关。
9. 下载：下载电子表格（48KB）
10. 表 S4。有利于生存的 MT2 微环境，与图 5 相关。
11. 下载：下载 Acrobat PDF 文件（30MB）
12. 文档 S2。文章加补充信息。