Nature | 斯坦福研究团队打造全新化合物，有望突破慢性疼痛治疗

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全球超过10亿人饱受慢性疼痛折磨，这不仅影响生活质量，还可能削弱工作能力，并导致或加重心理健康问题。目前，唯一稳定有效的慢性疼痛治疗手段是阿片类药物，但其伴随严重的成瘾风险和致命的过量使用问题。

斯坦福大学与圣路易斯华盛顿大学医学院的研究人员设计了一种新型化合物，有望用于慢性疼痛治疗。该化合物靶向1型大麻素（CB1）受体——这些蛋白分布在全身细胞表面，能够结合体内自然产生或源自大麻等植物的化学成分。在3月5日发表于《Nature》的论文中，研究团队展示了该化合物在小鼠模型中能有效缓解多种类型的疼痛，同时不会引发CB1受体常见的精神活性副作用，也不会导致耐受性形成。

慢性疼痛影响超过10% 的美国人口，并导致严重的残疾。现有的非阿片类治疗方法（如加巴喷丁类药物、选择性血清素再摄取抑制剂、三环类抗抑郁药和抗癫痫药）疗效有限，而阿片类药物存在滥用风险，过量使用可致命，因此迫切需要更安全、更有效的治疗方案。

1型大麻素受体（CB1）因广泛分布于疼痛传导通路，被认为是一个潜在的非阿片类镇痛靶点。尽管已有多种合成CB1激动剂（SCRAs）被发现，但其临床应用受限于两大挑战：中枢神经系统（CNS）副作用和耐受性。CB1激动剂可引发精神活性、副作用，如僵直、体温下降等，而已有的外周选择性CB1激动剂仍会在治疗剂量下激活中枢CB1受体。此外，CB1激动剂易产生耐受性，限制其长期疗效，且大多数SCRAs会强烈激活β-arrestin信号通路，被认为与耐受性相关。

研究团队通过合理设计新一代CB1激动剂，以减少中枢副作用和耐受性，同时保持高效镇痛作用。分子动力学模拟揭示了CB1受体中的隐性结合口袋，其中带负电的D1632.50残基可调控信号偏向性。基于这一发现，研究人员在激动剂上引入正电荷官能团，使其与该位点相互作用，从而优化选择性和疗效。

以高效SCRA MDMB-Fubinaca（FUB）为模板，研究团队设计了一系列新的CB1配体，其中领先化合物VIP36通过烷基链与末端胍基延伸至隐性口袋。实验结果显示，VIP36相较于FUB，显著降低了β-arrestin-2信号激活，同时保持高亲和力和G蛋白介导的效能。冷冻电镜研究与构效关系分析揭示了CB1受体此前未知的构象状态及其独特的信号特性。

VIP36在动物模型中展现出强效的外周CB1受体依赖性镇痛作用，并且耐受性极低。常见的中枢CB1副作用（如体温下降、僵直、镇静等）仅在镇痛剂量的100倍时才明显出现。这一研究不仅提供了有望安全有效治疗慢性疼痛的新型CB1激动剂，也为解析大麻素受体的信号调控机制提供了强有力的工具，并可能推广至其他G蛋白偶联受体（GPCR）研究领域。

计算配体设计

为了开发一种外周选择性激动剂，并最大程度减少β-arrestin信号，研究人员尝试引入带电官能团，以靶向CB1受体的D2.50位点。此前的研究表明，在GPCR核心区域靶向该位点可降低arrestin活性。然而，在所有已知的CB1结构中，芳香残基F2003.36和W3566.48（称为“切换残基”）阻挡了D2.50的直接可及性。此外，与其他GPCR不同，CB1受体的D2.50附近未发现明显的Na+结合位点，这进一步增加了该位点可利用性的疑问。

为探索D2.50是否在其他构象中可接近，研究人员对FUB结合的CB1受体进行了分子动力学模拟。结果发现了一个隐藏口袋，该口袋从正构结合位点延伸至D2.50位点，并在模拟过程中短暂开放（约8%的时间）。这一口袋的开放需要切换残基分离，特别是W3566.48的旋转。当口袋短暂开放时，配体可能进入并与D2.50形成稳定相互作用，从而锁定开放构象。这一发现验证了研究人员的设计思路，并为后续的结构引导优化提供了依据。

基于模拟所得的隐藏口袋构象，研究人员设计了一系列能够延伸至该位点的配体。以FUB骨架为起点，研究人员在其结构上引入了一个柔性链，并在末端连接带正电的官能团。利用分子对接和建模工具，研究人员优化了链长、连接点以及带电基团的选择。最终，研究人员选择了胍基作为带电基团，因其高pKa可在生理pH下保持带正电状态，有助于降低中枢渗透性。通过分子对接筛选，研究人员确定了最优配体VIP36（化合物8），其结构包括四碳O-烷基链连接FUB的吲唑环，并能与D2.50形成紧密相互作用。

下一代类似物的合成与药理学研究

研究人员合成了一系列尾部含胍基的FUB类似物，以验证结构模型的预测。所有新合成的配体化学结构如附图所示，核心化合物的合成路线也已列出。首先，研究人员探索了FUB骨架上不同的连接点，在吲唑环的4、5、6和7位引入四碳链，通过醚键连接，分别得到化合物8、14、21和27。

这些配体在CB1转染的HEK293T细胞系中进行了cAMP实验，以评估G蛋白信号活性。结果显示，当FUB的C6位被修饰时（化合物8），G蛋白信号活性最高（Emax=106%，EC50=2.17 nM）。这一结果与计算模型一致，因为C6位正好朝向隐藏口袋。此外，研究人员进一步评估了C6位链长变化（2至8个碳）对活性的影响，并通过cAMP和BRET（生物发光共振能量转移）实验分析G蛋白信号和β-arrestin-2募集情况。尽管不同链长的G蛋白信号活性差异不大，但当链长为4（即VIP36）时，β-arrestin-2募集效能明显降低，表现出最佳的G蛋白偏向性。这表明，该链长正好能够进入隐藏口袋，与D2.50位点相互作用。

相比之下，FUB表现为超激动剂，能够强烈募集β-arrestin-2（Emax=178%），而VIP36的β-arrestin-2募集效能仅为47%。体外GTP酶实验进一步证实，VIP36是G蛋白完全激动剂，且表现出对Gi1和Gi3亚型的选择性。此外，VIP36未检测到对CB1的β-arrestin-1募集，并在放射性配体竞争实验中显示出较高的受体亲和力（Ki=22 nM），明显优于FUB（Ki=75 nM）。

为了验证链结构对抑制β-arrestin募集的关键作用，研究人员合成了两种FUB类似物，其中一者用–OCH3（化合物4）取代，另一者用–OH（化合物5）取代。结果表明，这两种类似物的G蛋白效能均低于VIP36，且化合物5仍能强烈募集β-arrestin-2。

综上，实验数据验证了计算预测：VIP36的链连接位点和长度最优，能够有效打开切换残基，进入隐藏口袋并与D2.50相互作用，从而显著降低β-arrestin信号活性，相比母体分子FUB和对照化合物CP95,540更具优势。

通过隐藏口袋调控G蛋白信号偏向性的机制

为了揭示VIP36的G蛋白信号偏向性的分子机制，研究人员调整了配体头部官能团。结果发现，改变尾部的电荷或极性会显著影响arrestin募集。去除胍基电荷（如用碳链或苯环替代）会增强arrestin信号，而这些修饰仍可通过立体效应保持隐藏口袋的开放，说明口袋开放本身并不足以降低arrestin募集。相比之下，带正电的胺类似物仍维持低arrestin效能，而极性基团（如–CN、–OH、–COOH）均表现出高arrestin募集活性。此外，胍基的等排体（如方酰胺）比VIP36表现出更高的arrestin募集，表明尾部的正电荷或更强的碱性对于降低arrestin信号至关重要。

最显著的差异体现在VIP2.33（53号化合物），其通过用氧原子替换VIP36中的亚胺氮，导致arrestin募集效能提高约四倍，接近FUB的水平。为探究这一显著变化的机制，研究人员解析了VIP2.33结合CB1的冷冻电镜结构。结果显示，VIP36和VIP2.33的FUB骨架结构相似，但VIP2.33的连接链密度消失，表明其未形成稳定构象。此外，VIP2.33结合CB1后，W3566.48结构较为无序，而此前研究已表明W3566.48的不同构象可能影响CB1的信号偏向性。

为了进一步探讨这一现象，研究人员利用分子动力学模拟比较了VIP36、VIP2.33和FUB的分子相互作用。结果发现，VIP36与D2.50的相互作用强于VIP2.33，这可能是由于胍基可形成离子相互作用，而尿素基团只能偶尔形成氢键。此外，尽管两种配体均可分离“切换残基”，但仅VIP36能稳定跨膜螺旋7（TM7）在特定构象，而VIP2.33更倾向于采用不同的旋转构象。TM7的构象变化会影响GPCR的细胞内信号转导，而此前的研究表明，与VIP2.33类似的TM7构象通常与arrestin偏向信号相关。

研究人员进一步通过荧光探针实验检测了另一关键结构TM6的构象变化。结果显示，FUB结合后，TM6向外移动，暴露于溶剂中；VIP36结合后，这种效应更明显，而VIP2.33则趋向于恢复到未结合状态。这表明VIP36和VIP2.33稳定了不同的细胞内构象，从而影响Gi蛋白和arrestin的选择性结合。

综上，研究人员提出了一种结构机制：VIP36通过与D2.50和TM7的相互作用，形成一个稳定的相互作用网络，进而影响细胞内受体构象，从而实现G蛋白信号偏向性。这一机制为未来设计具有选择性信号调控功能的GPCR配体提供了重要参考。

讨论

CB1受体是开发非阿片类镇痛药的理想靶点，但其激活往往伴随中枢副作用，如精神活性效应，以及可能由arrestin介导的耐受性，这限制了其治疗窗口。此前，开发外周选择性CB1激动剂的尝试受限于这些化合物在镇痛剂量下仍能穿透中枢神经系统（CNS），因此迫切需要开发更具外周选择性的分子。本研究设计了一种外周选择性CB1激动剂，并减少β-arrestin-2募集，以验证高效SCRAs能否在保持镇痛活性的同时避免中枢副作用和arrestin介导的不良效应。

早期计算研究发现了一个隐藏口袋，并推测该口袋可用于靶向保守的D2.50残基。通过计算配体设计和药物化学优化，研究人员确定了VIP36，这一分子通过带电的胍基既限制了中枢渗透，又能与D2.50位点相互作用，从而减少arrestin募集。与母体化合物FUB相比，VIP36大幅降低了arrestin效能，同时保持了高效的G蛋白激活。冷冻电镜研究进一步证实，VIP36能够稳定隐藏口袋，与计算模型的预测一致。结构引导的药物化学研究也证明，配体尾部与D2.50的相互作用是CB1受体G蛋白信号偏向性的关键。

在动物实验中，VIP36在炎症性疼痛、神经病理性疼痛和偏头痛模型中均表现出良好的镇痛作用。特别是在慢性神经损伤（SNI）模型中，VIP36在9天（共18次给药）内持续维持抗痛觉过敏效应，而FUB及此前研究的CB13在炎症疼痛模型中均出现耐受现象。VIP36耐受性较低，可能与其较低的arrestin募集效能（Emax=47%）相关，而CB13和FUB的Emax分别为175%和178%。此外，VIP36的外周选择性使其镇痛效果与不良反应（如低体温）的出现至少相差100倍剂量，而FUB尽管镇痛效果强，但在ED50剂量下即表现出镇静作用，限制了其临床应用价值。

综上，研究人员成功设计了一种外周选择性的CB1镇痛剂VIP36，在多种外周疼痛模型中表现出良好疗效，并显著减少耐受性和不良反应。本研究不仅提供了CB1信号偏向性的深入机制解析，也有助于GPCR配体设计的整体理解，为其他GPCR靶向药物的功能选择性或外周选择性设计提供了新的思路。

整理 | WJM

参考资料

Rangari, V.A., O’Brien, E.S., Powers, A.S. et al. A cryptic pocket in CB1 drives peripheral and functional selectivity. Nature (2025).

https://doi.org/10.1038/s41586-025-08618-7