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社区首页 >专栏 >cellphonedb 及其可视化

cellphonedb 及其可视化

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生信技能树jimmy
发布于 2020-12-15 08:07:27
发布于 2020-12-15 08:07:27
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作者 | 周运来

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在单细胞数据分析过程中，上游的拆库定量，中游的分群注释，目前的门槛是很低的了。但是解析细胞类型异质性不应止于这些，还可以看细胞群之间的通讯。当然，这方面我们介绍过CellChat：细胞间相互作用分析利器。CellChat是以信号通路为单位来计算细胞间交流状态的，很多同学用cellphonedb来做基于配受体对的细胞间交流。今天，我们就来用经典的pbmc3k数据跑一下cellphonedb，并尝试可视化。

先放一张想象图：

来自文章：Single-cell transcriptomics reveals regulators underlying immune cell diversity and immune subtypes associated with prognosis in nasopharyngeal carcinoma

照例，请出我们的pbmc3k数据：

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library(Seurat)
library(SeuratData)
pbmc3k

An object of class Seurat 
13714 features across 2700 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)

head(pbmc3k@meta.data)
               orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA seurat_annotations
AAACATACAACCAC     pbmc3k       2419          779       Memory CD4 T
AAACATTGAGCTAC     pbmc3k       4903         1352                  B
AAACATTGATCAGC     pbmc3k       3147         1129       Memory CD4 T
AAACCGTGCTTCCG     pbmc3k       2639          960         CD14+ Mono
AAACCGTGTATGCG     pbmc3k        980          521                 NK
AAACGCACTGGTAC     pbmc3k       2163          781       Memory CD4 T

可以看出已经注释好了的，接下来我们写出跑cellphonedb的文件：表达谱和细胞分组文件。

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 write.table(as.matrix(pbmc3k@assays$RNA@data), 'cellphonedb_count.txt', sep='\t', quote=F)
 meta_data <- cbind(rownames(pbmc3k@meta.data), pbmc3k@meta.data[,'seurat_annotations', drop=F])  
meta_data <- as.matrix(meta_data)
  meta_dat[is.na(meta_data)] = "Unkown" #  细胞类型中不能有NA

 write.table(meta_data, 'cellphonedb_meta.txt', sep='\t', quote=F, row.names=F)

假设诸君已经安装好cellphonedb ，并加入环境变量了，我们可以这样跑：

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cellphonedb method statistical_analysis  cellphonedb_meta.txt  cellphonedb_count.txt      --counts-data=gene_name  # 如果是直接写出基因名的加这个参数，转化为基因ID的话不用加。

#cellphonedb 自己的绘图
cellphonedb plot dot_plot 
cellphonedb plot heatmap_plot cellphonedb_meta.txt

cellphonedb 结果文件需要挨个打开看看，不要只看名字。更多细节可以看官网的介绍，记住，官网对你是开放的。

https://www.cellphonedb.org/documentation

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ree out/
out/
├── count_network.txt  # 绘制网络图文件
├── deconvoluted.txt
├── heatmap_count.pdf
├── heatmap_log_count.pdf
├── interaction_count.txt
├── means.txt # 绘制点图文件
├── plot.pdf
├── pvalues.txt  # 绘制点图文件 
└── significant_means.txt

下面在R中对结果进行可视化演练，主要是网络图和点图。点图我们知道ggplot的同学都不陌生了，就是网络图一看就让人头大，好在之前你们家运来小哥哥抄完了网络数据的统计分析：R语言实战一书，算是知道些皮毛，可以在这里用上啦。

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pbmc='D:\\SingleCell\\out\\' ##  outs 文件放在这里了。

library(psych)
library(qgraph)
library(igraph)

netf<- "count_network.txt"
mynet <- read.delim(paste0(pbmc,"count_network.txt"), check.names = FALSE)
head(mynet)
        SOURCE       TARGET count
1 Memory CD4 T Memory CD4 T     3
2 Memory CD4 T            B    10
3 Memory CD4 T   CD14+ Mono    14
4 Memory CD4 T           NK    15
5 Memory CD4 T        CD8 T     6
6 Memory CD4 T  Naive CD4 T     3

net<- graph_from_data_frame(mynet)

plot(net)

读入网络数据，构建网络，并绘制最简单的一张网络图：

为了给这个网络图的边点mapping上不同的属性我们引入一串颜色。

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allcolour=c("#DC143C","#0000FF","#20B2AA","#FFA500","#9370DB",
            "#98FB98","#F08080","#1E90FF","#7CFC00","#FFFF00",
            "#808000","#FF00FF","#FA8072","#7B68EE","#9400D3",
            "#800080","#A0522D","#D2B48C","#D2691E","#87CEEB",
            "#40E0D0","#5F9EA0","#FF1493",
            "#FFE4B5","#8A2BE2","#228B22","#E9967A","#4682B4",
            "#32CD32","#F0E68C","#FFFFE0","#EE82EE","#FF6347",
            "#6A5ACD","#9932CC","#8B008B","#8B4513","#DEB887")

karate_groups <- cluster_optimal(net)
coords <- layout_in_circle(net, order =
                             order(membership(karate_groups)))  # 设置网络布局

E(net)$width  <- E(net)$count/10  # 边点权重（粗细）
plot(net, edge.arrow.size=.1, 
     edge.curved=0,
     vertex.color=allcolour,
     vertex.frame.color="#555555",
     vertex.label.color="black",
     layout = coords,
     vertex.label.cex=.7)

经过以上一番修饰后，我们得到的网络图如下：

但是边的颜色和点的颜色还是对应不上，我们来修改一番边的属性。

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net2 <- net  # 复制一份备用

for (i in 1: length(unique(mynet$SOURCE)) ){
  E(net)[map(unique(mynet$SOURCE),function(x) {
    get.edge.ids(net,vp = c(unique(mynet$SOURCE)[i],x))
  })%>% unlist()]$color <- allcolour[i]
}  # 这波操作谁有更好的解决方案？ 

plot(net, edge.arrow.size=.1, 
     edge.curved=0,
     vertex.color=allcolour,
     vertex.frame.color="#555555",
     vertex.label.color="black",
     layout = coords,
     vertex.label.cex=.7)

至此，文章开头的第一张图就复现出来了。我们观察到由于箭头是双向的，所以两个细胞类型之间的线条会被后来画上去的覆盖掉（开头那张网络图也有这个问题吗？），这里我们把线条做成曲线：

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plot(net, edge.arrow.size=.1, 
     edge.curved=0.2, # 只是调了这个参数
     vertex.color=allcolour,
     vertex.frame.color="#555555",
     vertex.label.color="black",
     layout = coords,
     vertex.label.cex=.7)

这下清晰很多了。

接下来，我们来绘制第二组类型贝壳一样的网络图。

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dev.off()
length(unique(mynet$SOURCE)) # 查看需要绘制多少张图，以方便布局
par(mfrow=c(2,5), mar=c(.3,.3,.3,.3))

for (i in 1: length(unique(mynet$SOURCE)) ){
  net1<-net2
  E(net1)[map(unique(mynet$SOURCE),function(x) {
    get.edge.ids(net,vp = c(unique(mynet$SOURCE)[i],x))
  })%>% unlist()]$color <- allcolour[i]

  plot(net1, edge.arrow.size=.1, 
       edge.curved=0.4,
       vertex.color=allcolour,
       vertex.frame.color="#555555",
       vertex.label.color="black",
       layout = coords,
       vertex.label.cex=1) 

}

这样是不是清晰了许多呢？

但是，细胞间通讯的频数（count）并没有绘制在图上，略显不足，这就补上吧。

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dev.off()
length(unique(mynet$SOURCE))
par(mfrow=c(2,5), mar=c(.3,.3,.3,.3))

for (i in 1: length(unique(mynet$SOURCE)) ){
  net1<-net2

  E(net1)$count <- ""
  E(net1)[map(unique(mynet$SOURCE),function(x) {
    get.edge.ids(net,vp = c(unique(mynet$SOURCE)[i],x))
  })%>% unlist()]$count  <- E(net2)[map(unique(mynet$SOURCE),function(x) {
    get.edge.ids(net,vp = c(unique(mynet$SOURCE)[i],x))
  })%>% unlist()]$count  # 故技重施

  E(net1)[map(unique(mynet$SOURCE),function(x) {
    get.edge.ids(net,vp = c(unique(mynet$SOURCE)[i],x))
  })%>% unlist()]$color <- allcolour[i]

  plot(net1, edge.arrow.size=.1, 
       edge.curved=0.4,
       edge.label = E(net1)$count, # 绘制边的权重
       vertex.color=allcolour,
       vertex.frame.color="#555555",
       vertex.label.color="black",
       layout = coords,
       vertex.label.cex=1
  ) 

}

需要再做一些调整就可以啦。

找两条边验证一下对应关系。

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mynet %>% filter(SOURCE  == 'B',TARGET == 'DC')
  SOURCE TARGET count
1      B     DC    18

 mynet %>% filter(SOURCE  == 'Memory CD4 T',TARGET == 'B')
        SOURCE TARGET count
1 Memory CD4 T      B    10

用ggplot2 绘制点图，关键是把两张表合并到一起。

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mypvals <- read.delim(paste0(pbmc,"pvalues.txt"), check.names = FALSE)
mymeans <- read.delim(paste0(pbmc,"means.txt"), check.names = FALSE)

# 这些基因list很有意思啊，建议保存
chemokines <- grep("^CXC|CCL|CCR|CX3|XCL|XCR", mymeans$interacting_pair,value = T)
chemokines <- grep("^CXC|CCL|CCR|CX3|XCL|XCR", mymeans$interacting_pair,value = T)
th1 <- grep("IL2|IL12|IL18|IL27|IFNG|IL10|TNF$|TNF |LTA|LTB|STAT1|CCR5|CXCR3|IL12RB1|IFNGR1|TBX21|STAT4", 
            mymeans$interacting_pair,value = T)
th2 <- grep("IL4|IL5|IL25|IL10|IL13|AREG|STAT6|GATA3|IL4R", 
            mymeans$interacting_pair,value = T)
th17 <- grep("IL21|IL22|IL24|IL26|IL17A|IL17A|IL17F|IL17RA|IL10|RORC|RORA|STAT3|CCR4|CCR6|IL23RA|TGFB", 
             mymeans$interacting_pair,value = T)
treg <- grep("IL35|IL10|FOXP3|IL2RA|TGFB", mymeans$interacting_pair,value = T)
costimulatory <- grep("CD86|CD80|CD48|LILRB2|LILRB4|TNF|CD2|ICAM|SLAM|LT[AB]|NECTIN2|CD40|CD70|CD27|CD28|CD58|TSLP|PVR|CD44|CD55|CD[1-9]", 
                      mymeans$interacting_pair,value = T)
coinhibitory <- grep("SIRP|CD47|ICOS|TIGIT|CTLA4|PDCD1|CD274|LAG3|HAVCR|VSIR", 
                     mymeans$interacting_pair,value = T)
niche <- grep("CSF", mymeans$interacting_pair,value = T)

mymeans %>% dplyr::filter(interacting_pair %in% costimulatory)%>%
  dplyr::select("interacting_pair",starts_with("NK"),ends_with("NK"))  %>%  
  reshape2::melt() -> meansdf

colnames(meansdf)<- c("interacting_pair","CC","means")

mypvals %>% dplyr::filter(interacting_pair %in% costimulatory)%>%
  dplyr::select("interacting_pair",starts_with("NK"),ends_with("NK"))%>%  
  reshape2::melt()-> pvalsdf

colnames(pvalsdf)<- c("interacting_pair","CC","pvals")
pvalsdf$joinlab<- paste0(pvalsdf$interacting_pair,"_",pvalsdf$CC)
meansdf$joinlab<- paste0(meansdf$interacting_pair,"_",meansdf$CC)
pldf <- merge(pvalsdf,meansdf,by = "joinlab")

summary((filter(pldf,means >1))$means)

pldf%>% filter(means >1) %>% 
  ggplot(aes(CC.x,interacting_pair.x) )+ 
  geom_point(aes(color=means,size=-log10(pvals+0.0001)) ) +
  scale_size_continuous(range = c(1,3))+
  scale_color_gradient2(high="red",mid = "yellow",low ="darkblue",midpoint = 25  )+ theme_bw()+ 
  theme(axis.text.x = element_text(angle = -45,hjust = -0.1,vjust = 0.8))

这部分写的略显臃肿，勉强可用吧。

番外篇：在不能用--counts-data=gene_name时，我们可以如何转化基因ID呢。这里提供一种思路：用Seurat读两次数据，一次是基因SYMBOL，一次是ENTREZID（cellranger提供的便利）。方法是从10X的输出中直接读取带有ENTREZID的矩阵，如下从这个矩阵中匹配出目标矩阵。

读入数据的时候gene.column = 1默认为2（SYMBOL）。

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Read10X(
  data.dir = NULL,
  gene.column = 1,
  unique.features = TRUE,
  strip.suffix = FALSE
)
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seurat2cellphonedb<- function(seosym,seo,groups,group1,celltype){
  Idents(seo) <- groups
  myseogroup <- subset(seo,idents =group1)
  myseogroup1 <-  subset(seosym,cells=colnames(myseogroup ))
  count_raw <- myseogroup1@assays$RNA@counts
  count_norm <- apply(count_raw, 2, function(x) (x/sum(x))*10000)
  write.table(count_norm, paste0(group1,"_cellphonedb_count.txt"), sep='\t', quote=F)
  meta_data <- cbind(rownames(myseogroup@meta.data),myseogroup@meta.data[,celltype, drop=F])
  write.table(meta_data, paste0(group1,'_cellphonedb_meta.txt'), sep='\t', quote=F, row.names=F)
}

$cellphonedb method statistical_analysis   cseocellphonedb_meta.txt  C_cellphonedb_count.txt

$cellphonedb plot dot_plot
$cellphonedb plot heatmap_plot yourmeta.txt

References

[1] 细胞配受体通识以及常见细胞分泌信号通路: https://www.jianshu.com/p/df4721d29a91 [2] CellChat：细胞间相互作用分析利器: https://www.jianshu.com/p/da145cff3d41 [3] CellChat：细胞间相互作用在线内容: https://www.jianshu.com/p/e5ff8140f388 [4] Cell-Cell Interaction Database|| 单细胞配受体库你还在文章的附录里找吗？: https://www.jianshu.com/p/49613adce465 [5] celltalker：单细胞转录组配受体分析: https://www.jianshu.com/p/2c2f94b4f072 [6] Network在单细胞转录组数据分析中的应用: https://www.jianshu.com/p/23e46ad14a3e [7] CellChat：细胞间相互作用分析利器: https://www.jianshu.com/p/da145cff3d41 [8] Single-cell transcriptomics reveals regulators underlying immune cell diversity and immune subtypes associated with prognosis in nasopharyngeal carcinoma:https://www.nature.com/articles/s41422-020-0374-x#Abs1 [9] https://www.cellphonedb.org/documentation [10] 网络数据的统计分析：R语言实战: https://www.jianshu.com/nb/47898774 [11] https://www.cellphonedb.org/faq-and-troubleshooting [12] https://github.com/Teichlab/cellphonedb/blob/master/cellphonedb/src/plotters/R/plot_heatmaps.R [13] https://github.com/zktuong/ktplots/

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【审视】Scrum Master的检查清单
敏捷开发
一般情况下，一个Scrum Master如果更多的是做组织会议、确保时间盒以及对流程中的障碍快速响应等事项的话，可以同时引导2-3个团队。在这种情况下，团队会在降低问题发生率的基础上提高一定的绩效。
敏捷开发
2022/04/26
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【审视】Scrum Master的检查清单
如何实现Scrum敏捷转型？
TAPD 敏捷项目管理敏捷开发
随着敏捷项目管理模式在国内的流行，各流派敏捷实践培训风起云涌，Scrum框架的相关实践和案例最多，也最为国内推崇。然而在实际应用中，我们会遇到怎么样的阻碍？如何突破这些阻碍，让客户满意，提升客户交付价值？
砖家认证
2020/05/14
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技术分享 | 想测试入门就必须要懂的软件开发流程
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从事软件测试行业，每天面对的被测对象都是软件。如果想要更好的去完成测试工作，首先需要对被测对象，也就是对软件要有基本的了解。
用户9652437
2022/04/18
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敏捷和Scrum之间的区别
scrum工作管理敏捷
当一个新人进入项目管理领域时，在这个充满挑战和专业化的行业中，通过他们可能遇到的陌生术语和流程似乎令人生畏。事实上，项目经理的任务是作为项目管理团队的成员来管理项目的各个方面，代表各种任务和职责。在管理项目的整个过程中，项目经理有责任制定一种系统的方法来规划和执行他们所监督的项目，包括所有必需的辅助计划。选择正确的项目管理方法对于指导您的工作和确保项目成功至关重要。有许多方法可以在项目管理中使用，但敏捷和Scrum是两种最常见的方法。
jack.yang
2025/04/05
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敏捷和Scrum之间的区别
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AI码师0
LV.1
这个人很懒，什么都没有留下～
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