无细胞蛋白表达与SPR动力学分析：Nuclera eProtein Discovery加速BTK抑制剂筛选工作流

摘要

无细胞蛋白表达系统（Cell-Free Protein Synthesis，CFPS）近年来在蛋白工程、靶点验证以及药物筛选领域受到越来越多关注。相比传统细胞表达体系，无细胞表达能够显著缩短蛋白生产周期，并提高复杂蛋白的表达筛选效率。本文基于Nuclera eProtein Discovery系统与Biacore SPR技术公开资料，对BTK抑制剂筛选中的无细胞蛋白表达、构建体优化、生物素化修饰以及SPR动力学分析流程进行整理，并介绍从DNA到蛋白功能表征的自动化工作流。

关键词：无细胞蛋白表达、无细胞蛋白合成、CFPS、BTK抑制剂、eProtein Discovery、Biacore SPR、蛋白表达筛选、药物筛选、激酶研究、动力学分析、蛋白功能表征

一、无细胞蛋白表达在药物研发中的应用价值

在药物研发过程中，蛋白靶点的快速表达与功能验证始终是影响研发效率的重要环节。传统细胞表达体系虽然已经广泛应用，但在复杂蛋白、膜蛋白以及高通量筛选场景下，往往存在表达周期长、构建优化复杂以及蛋白稳定性不足等问题。

无细胞蛋白表达系统（CFPS）则通过体外转录翻译体系，实现从DNA模板到功能蛋白的快速生产，从而大幅缩短实验周期。近年来，随着数字微流控技术、高通量筛选以及自动化工作流的发展，无细胞表达体系逐渐成为蛋白工程及药物筛选的重要工具之一。

Nuclera公司的eProtein Discovery系统采用数字微流控卡盒与定制试剂体系，可同时筛选多种蛋白构建体及表达条件，并实现从表达、纯化到功能分析的快速衔接。

Nuclera无细胞蛋白表达系统

图1：Nuclera无细胞蛋白表达系统

该系统可同时自动筛选多达24种可溶性蛋白或11种膜蛋白，并对每种蛋白评估多个表达条件。筛选结果还可用于后续体内表达优化，包括大肠杆菌菌株选择及质粒设计等流程。

二、BTK激酶为何成为重要药物研发靶点

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是B细胞受体信号通路中的关键分子，在白血病、淋巴瘤以及自身免疫疾病研究中具有重要意义。

目前，第一代BTK抑制剂虽然已广泛应用，但仍存在耐药性以及脱靶效应问题。第二代抑制剂在选择性方面有所改善，但仍受到耐药突变及生物利用度限制。近年来，非共价BTK抑制剂由于对部分耐药突变仍保持活性，因此受到越来越多关注。

由于非共价抑制剂与BTK之间属于可逆结合，因此需要通过详细动力学分析评估其结合能力、解离速度以及稳定性。这也使SPR等实时分子互作分析技术在BTK研究中具有重要价值。

三、从DNA到SPR分析的自动化工作流程

本研究建立了一套从DNA模板到蛋白功能表征的自动化工作流，整体流程可在约5天内完成。

首先，通过eProtein Discovery系统对不同BTK构建体进行表达与纯化条件筛选；随后对最佳条件进行规模放大，并完成蛋白生物素化修饰；之后通过缓冲液交换去除多余生物素；最后利用Biacore SPR系统完成药物与BTK之间的动力学分析。

5天工作流程实现从DNA到蛋白表征

图2：5天工作流程实现从DNA到蛋白表征

相比传统流程，该方案能够显著缩短蛋白筛选与功能验证周期。

四、BTK蛋白表达与构建体筛选

研究中首先设计了三种BTK构建体，包括全长BTK、截短变体以及激酶结构域片段，并利用eProtein Discovery系统在多种可溶性标签及无细胞表达条件下进行筛选。

实验结果显示，仅保留激酶结构域的BTK392-659在表达量与纯化效率方面表现更优，说明通过构建体优化能够显著提升蛋白生产效率。

BTK构建体AlphaFold预测结构

192种条件下的表达筛选结果

纯化筛选结果

图3：BTK变体表达与纯化筛选结果

研究进一步对Avi标签位置进行优化，将标签分别引入BTK蛋白N端及C端，以评估其对表达及后续SPR分析的影响。

结果显示，不同标签位置虽然不会明显影响蛋白表达，但会对后续芯片捕获效率产生影响。

Avi标签BTK构建体设计

带Avi标签BTK表达与纯化筛选

图4：带Avi标签BTK蛋白表达与纯化筛选结果

五、BTK蛋白规模放大与生物素化修饰

在完成构建体筛选后，研究人员对优化后的BTK蛋白进行规模放大生产，并利用SDS-PAGE验证蛋白纯度与产量。

规模放大BTK蛋白SDS-PAGE分析

图5：规模放大BTK蛋白SDS-PAGE分析结果

随后采用BirA连接酶完成Avi标签蛋白的生物素化修饰，并通过缓冲液交换去除残余生物素。

Western blot分析结果显示，N端与C端带Avi标签的BTK蛋白均成功完成生物素化修饰。

BTK蛋白生物素化Western blot分析

图6：BTK蛋白生物素化Western blot分析结果

六、利用SPR技术分析BTK与抑制剂结合动力学

在SPR实验中，研究人员分别评估了N端与C端生物素化BTK蛋白在Sensor Chip SA及NA芯片上的捕获效率。

结果显示，N端生物素化BTK在芯片表面表现出更好的捕获能力，而C端修饰则可能由于空间位阻影响结合效率。

随后研究人员进一步分析了BTK与fenebrutinib及vecabrutinib之间的结合动力学。

BTK与抑制剂SPR分析结果

图7：BTK与抑制剂结合的SPR传感器图

实验结果表明，eProtein Discovery系统表达的BTK蛋白能够保持良好功能活性，并可直接用于SPR动力学分析。

七、总结

随着药物研发对高通量、自动化以及快速决策能力要求不断提高，无细胞蛋白表达系统正在成为蛋白工程与靶点筛选领域的重要技术路线。

本研究展示了一套基于Nuclera eProtein Discovery系统与Biacore SPR技术的自动化工作流程，可在约5天内完成从DNA模板到BTK蛋白功能表征的完整过程。

通过构建体优化、表达筛选、生物素化修饰以及SPR动力学分析相结合，该方案能够显著提升BTK抑制剂筛选效率，并为激酶药物研发提供更高效的数据支持。

关于技术来源：本文基于无细胞蛋白表达、无细胞蛋白合成、cell-free system等公开技术资料、参考文献、技术文章曼博生物整理，用于科研技术交流和实验参考等。