🤩 Journal Club | 单细胞与空间转录组学揭示骨骼肌纤维化中的关键巨噬细胞亚群

研究背景

肌肉不仅是运动的引擎，更是高度动态的组织。在健康状态下，巨噬细胞像“维修工”一样清除损伤碎片、促进再生。😘

然而，在杜氏肌营养不良（DMD）等慢性肌肉疾病中，巨噬细胞的调控机制“失控”，从修复者转变为“破坏者”，推动异常纤维化（胶原堆积），最终导致肌肉功能丧失。🫠

传统观点认为，巨噬细胞可分为促炎的M1型和修复的M2型，但这一分类在慢性疾病中是否适用？哪些分子驱动巨噬细胞“黑化”？它们如何与基质细胞“串通”促进纤维化？这些问题尚未明确。😅

为此，研究者采用单细胞转录组（scRNA-seq）和空间转录组（spatial transcriptomics）技术，对健康与病变肌肉中的巨噬细胞展开“细胞普查”，首次揭示了肌营养不良中一群独特的促纤维化巨噬细胞亚群，gal-3+巨噬细胞。😏

研究结果一

利用单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析骨骼肌中巨噬细胞亚群的转录异质性，尤其关注病变（mdx）与健康（WT）组织中的差异：👇

• 图1A：明确实验设计，采集4周龄WT与mdx小鼠肌肉进行单细胞测序；
• 图1B：UMAP聚类揭示骨骼肌巨噬细胞存在多个亚群，且病变与健康组织差异明显；
• 图1C：Gal-3+巨噬细胞（Cluster 0）在mdx肌肉中显著增加，而驻留巨噬细胞（Cluster 1）主要存在于健康组织；
• 图1D：基因型（WT与mdx）显著影响巨噬细胞的转录特征；
• 图1E：Gal-3+巨噬细胞特异高表达Lgals3、Spp1等纤维化相关基因，提示其在肌肉纤维化中具有关键作用。

研究结果二

利用单细胞转录组和基因表达分析，探讨骨骼肌巨噬细胞亚群（特别是Gal-3+巨噬细胞）的转录组特征，明确其与经典M1、M2巨噬细胞的差异：👇

• 图2A-C：热图展示了FACS分选出的三种主要巨噬细胞群（SkMRM、Gal-3+巨噬细胞、MDM）在单细胞转录组中各自特征基因表达谱，确认了三种细胞群的清晰区别；
• 图2D：主成分分析（PCA）进一步验证了SkMRM、Gal-3+巨噬细胞和MDM之间转录谱的明显差异；
• 图2E：Gal-3+巨噬细胞相较于SkMRM显著富集细胞外基质（ECM）相关通路的基因；
• 图2F：直接比较Gal-3+巨噬细胞与SkMRM的基因表达，明确显示Lgals3和Spp1是Gal-3+巨噬细胞中特异且高表达的关键基因；
• 图2G-H：Gal-3+巨噬细胞与MDMs相对于SkMRMs具有大量重叠的差异基因，但并不符合经典的M1或M2巨噬细胞表达特征；
• 图2I-J：进一步验证M1、M2标记基因在Gal-3+巨噬细胞、MDMs和SkMRMs中的表达情况，强调Gal-3+巨噬细胞表现出独特的转录特征，不同于传统M1、M2分类。

研究结果三

利用空间转录组学（spatial transcriptomics）和免疫荧光共聚焦技术，分析Gal-3+巨噬细胞与肌肉纤维化区域的空间定位关系：👇

• 图3A：空间转录组显示Lgals3（Gal-3基因）在D2-mdx小鼠股四头肌病变区域显著高表达；
• 图3B：对应的H&E病理染色展示了D2-mdx股四头肌肌肉组织的典型病变特征；
• 图3C：热图分析比较Lgals3高表达区（Lgals3^hi）与低表达区（Lgals3^lo）的差异表达基因，揭示Gal-3高表达区域明显富集与纤维化相关的基因；
• 图3D-E：GO富集分析显示，Lgals3高表达区域显著富集ECM（图3D）及成纤维细胞相关通路（图3E）；
• 图3F：进一步展示纤维化相关差异基因（如Col1a1、Col1a2、Col6a1、Col6a2）在Gal-3高表达区域显著上调；
• 图3G：空间转录组显示基质细胞标记基因Pdgfra在mdx肌肉病变区域表达显著增加；
• 图3H：免疫荧光染色验证Gal-3蛋白（绿色）阳性巨噬细胞与PDGFRα（白色）阳性的成纤维细胞及胶原（红色）在mdx肌肉组织中空间紧密共定位。

研究结果四

利用细胞通讯分析（CellChat）和功能验证实验，探讨Spp1在mdx肌肉中Gal-3+巨噬细胞与纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）之间相互作用的作用机制：👇

• 图4A：将3月龄WT和mdx小鼠骨骼肌单核细胞转录组数据进行整合，作为细胞通讯分析的基础；
• 图4B-D：CellChat细胞通讯分析明确以巨噬细胞亚群为中心，mdx小鼠肌肉中的Gal-3+巨噬细胞与其他细胞（尤其是FAPs）之间通讯明显增强；
• 图4E：通路分析显示mdx小鼠中显著富集Spp1介导的巨噬细胞与FAPs之间的通讯通路；
• 图4F：进一步分析明确Spp1在配体（巨噬细胞）-受体（FAPs）通讯对中具有关键贡献；
• 图4G-J：流式细胞术分析证实mdx小鼠FAPs显著上调Spp1的主要受体（如CD44和Itgav, Itgb3）；
• 图4K-M：RNAscope原位杂交联合免疫荧光染色证实mdx小鼠肌肉中F480+巨噬细胞表达Spp1 mRNA，且与胶原富集区域共定位；
• 图4N：ELISA检测进一步验证Gal-3+巨噬细胞分泌大量Spp1蛋白；
• 图4O-P：功能实验表明Gal-3+巨噬细胞条件培养基能够显著促进FAPs中纤维化基因（Acta2和Col1a1）表达增加，而中和Spp1抗体显著抑制这种作用，证实Gal-3+巨噬细胞通过分泌Spp1促进FAPs向成纤维分化，从而参与纤维化。

研究结果五

通过不同慢性肌肉病模型及动态分析，探讨Gal-3+巨噬细胞的持续激活状态：👇

• 图5A：在mdx小鼠骨骼肌中，Gal-3+巨噬细胞数量随年龄增长持续增加，并长期存在；
• 图5B-C：流式细胞术显示，在年轻（4周龄）和年老（52周龄）mdx小鼠中，巨噬细胞内Gal-3蛋白的表达强度（MFI）均显著增加；
• 图5D：Picrosirius红染证实，Gal-3+巨噬细胞长期增加伴随肌肉纤维化加重；
• 图5E-F：在VCP相关包涵体肌病模型（IBM）和面肩肱型肌营养不良（TIC-DUX4）小鼠模型中，Gal-3+巨噬细胞数量也显著增加；
• 图5G-H：急性肌肉损伤模型（CTX）中Gal-3+巨噬细胞短暂增加后迅速下降，表明Gal-3+巨噬细胞的长期存在与慢性肌肉病理进展密切相关。

研究结果六

通过细胞转移和谱系示踪实验，探讨Gal-3+巨噬细胞的细胞来源及环境影响因素：👇

• 图6A-B：外周单核细胞转移实验表明，外周单核细胞在mdx肌肉中可以显著转化为Gal-3+巨噬细胞；
• 图6C-D：骨骼肌驻留巨噬细胞（SkMRMs）转移到mdx小鼠肌肉后，也能显著转变为Gal-3+巨噬细胞；
• 图6E-F：将Gal-3+巨噬细胞转移至健康（WT）肌肉组织中，发现其难以维持Gal-3表达状态，提示疾病微环境对其形成起关键作用；
• 图6G-I：RT-qPCR进一步证实mdx肌肉中Gal-3+巨噬细胞、驻留巨噬细胞（SkMRMs）与MDMs在关键基因表达上存在显著差异，证实mdx疾病微环境驱动巨噬细胞转向Gal-3+状态。

研究结果七

在人类慢性肌肉疾病患者中，验证Gal-3+巨噬细胞增加与肌肉纤维化进展的临床相关性：👇

• 图7A：免疫荧光染色发现人类包涵体肌病（IBM）患者肌肉组织中存在大量CD68+/Gal-3+双阳性巨噬细胞；
• 图7B：免疫组化证实在多种人类肌肉病患者（包括DMD、LGMD等）肌肉组织中Gal-3+巨噬细胞明显增加；
• 图7C-E：定量分析发现，Gal-3+巨噬细胞在病变肌肉组织的间质空间、血管周围区域和肌纤维内显著增加；
• 图7F-G：进一步证实Gal-3+巨噬细胞升高伴随人类患者肌肉组织中纤维化标志基因SPP1和COL1A的mRNA表达显著上调，提示Gal-3+巨噬细胞在慢性肌肉疾病纤维化进程中具有重要临床意义。

总结一下

• 明确了骨骼肌巨噬细胞具有显著的异质性，并首次定义了一个特殊的巨噬细胞亚群，Gal-3+巨噬细胞；
• Gal-3+巨噬细胞在病变骨骼肌组织（mdx小鼠及人类慢性肌病患者）中显著增加，并持续活化；
• 空间转录组与细胞通讯分析证实，Gal-3+巨噬细胞与纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）之间通过Spp1信号通路密切相互作用，并促进FAPs向成纤维方向分化，直接参与肌肉纤维化过程；
• 细胞来源追踪实验表明，Gal-3+巨噬细胞可来源于外周单核细胞和肌肉驻留巨噬细胞，疾病微环境是其形成的关键因素；
• 在人类慢性肌肉疾病患者中，Gal-3+巨噬细胞的增加与纤维化程度高度相关，强调了这一细胞群在肌肉纤维化病理中的潜在治疗价值。