Nature | 单细胞CAR-T图谱揭示了8年白血病缓解中的2型功能

生信菜鸟团

发布于 2024-11-23 11:35:36

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Basic Information

英文标题： Single-cell CAR T atlas reveals type 2 function in 8-year leukaemia remission
中文标题：单细胞CAR-T图谱揭示了8年白血病缓解中的2型功能
发表日期：25 September 2024
文章类型：Article
所属期刊：Nature
文章作者：Zhiliang Bai | Rong Fan
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07762-w

Abstract

Para_01

尽管嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在急性淋巴细胞白血病（ALL）中具有高响应率1,2,3，但大约50%的患者在第一年内复发4,5,6，这成为细胞免疫疗法下一阶段需要迫切解决的问题。
为了研究超长CAR T细胞持久性的分子决定因素，我们从82名参与前两项CAR T ALL临床试验的ALL儿科患者和6名健康捐赠者的695,819个预处理CAR T细胞中获得了单细胞多组学图谱，这些细胞处于基础水平或经过CAR特异性刺激后。
我们发现，CAR T输注产品中2型功能的提升与患者维持中位B细胞发育不全持续时间8.4年显著相关。
配体-受体相互作用的分析揭示了2型细胞通过调节功能失调的亚群来维持整体群体稳态，并且在抗原特异性激活过程中添加IL-4可以缓解CAR T细胞功能失调，同时增强其在转录组和表观基因组水平的适应性。
治疗后血清的连续蛋白质组学分析显示，5年或8年无复发的响应者中循环2型细胞因子的水平较高。
在白血病小鼠模型中，2型高CAR T细胞产品表现出优越的扩张和抗肿瘤活性，特别是在白血病再次挑战后。
通过增强2型功能，无论是将IL-4纳入制造过程，还是在输注前用IL-4预处理制造的CAR T产品，都可以恢复2型低CAR T细胞的抗肿瘤效力。
我们的发现为持久CAR T疗法响应的介质提供了见解，并提出了通过增强CAR T细胞中的2型功能来维持长期缓解的潜在治疗策略。

Main

Para_01

CD19定向的CAR-T细胞疗法已被证明在治疗儿童和年轻成人复发或难治性急性淋巴细胞白血病方面非常有效。
尽管早期试验显示出异常高的初始反应率，但复发频繁发生，且模式各异，大约一半的患者在CAR-T输注后1年内未能维持无事件生存，突显出探究调控长期持久缓解的分子复杂性的新兴未满足需求。

Para_02

CAR T细胞的持续功能性高度与临床反应相关。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步揭示了导致CAR T细胞持久存在的分子机制。
尽管有这些见解，大多数单细胞CAR T分析数据来自临床随访不足2年的患者，关于介导超过5年的超长缓解期的特征性输注产品标志物仍存在相当大的知识空白。
我们最近对输注前CAR T细胞进行的scRNA-seq分析显示，在12名患者的小队列中，与持续5年无复发的应答者相比，CD19+复发患者的T辅助2（TH2）细胞功能存在缺陷，但我们尚未进一步阐明其潜在的生物学机制及其对超过5年的长期反应的影响。

Patient cohort and study design

Para_01

我们详细审查了来自82名复发和/或难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）儿科患者的预处理CD19定向CAR T（CTL019）细胞产品，以及来自6名健康供体（HDs）的CTL019细胞（补充表1）。
其中，42名参与患者于2012年纳入一项单中心I/IIA期试点临床试验（ClinicalTrials.gov: NCT01626495），另外40名患者参与了一项双队列、开放标签的试点研究（ClinicalTrials.gov: NCT02906371）。
这两项试验中的CTL019细胞使用了一种带有CD3ζ域的CAR用于T细胞激活，以及一个提供共刺激信号的CD137（4-1BB）域。
患者的人口统计数据从2012年9月收集至2022年7月，随访期限在终点时延长至106个月。
在我们队列中，有6名患者根据形态学评估对治疗无客观反应（无反应者（NR）；n = 6）。
73名患者达到完全缓解（<5%白血病原始细胞），且为微小残留病阴性，另有3名患者为微小残留病阳性。
其中，24名患者在平均9.2个月时出现CD19+ ALL细胞的复发（CD19+复发，RL+；n = 24），而27名患者在平均8.9个月时出现白血病细胞中CD19表达丢失的复发（CD19−复发，RL−；n = 27）。
剩余患者在最后一次联系时表现出持续且强劲的无复发缓解（完全反应者（CR）；n = 25）。
为了始终如一地捕获真实的CAR特异性免疫突触，我们构建了一种表达人CD19的小鼠NIH3T3细胞系（CD19-3T3）作为抗原呈递细胞（APCs），通过其CAR专门激活CAR T产品。
结合scRNA-seq和CITE-seq12，我们对基础未刺激的CAR T细胞和激活的CAR+细胞进行了多组学分析，并通过流式细胞术和多重分泌组学检测进行独立评估（图1a和扩展数据图1a）。

Fig. 1: Single-cell atlas of 695,819 CAR T cells from 82 patients and 6 HDs.

a, 实验设计的示意图。该图使用BioRender创建。
b, 695,819个高质量单CAR T细胞的UMAP可视化，这些细胞是从所有患者和供体的1,029,340个测序细胞中筛选出来的。无监督聚类识别出17个不同的簇。
c, 患者人口统计学和临床文档。根据BCA持续时间，患者被分为五个持久性组。发现队列包括来自临床试验NCT01626495的42名患者，验证队列包括来自临床试验NCT02906371的40名患者。IPA，创新通路分析；Tc，细胞毒性T细胞；Treg，调节性T细胞。

Single-cell atlas of pre-infusion CAR T cells

Para_01

我们从总共1,029,340个预输注CAR T细胞中获取了单细胞转录组和表面蛋白表位测序数据，实现了每个细胞平均40,497个读数的测序深度（补充表2）。
在排除低质量细胞和潜在的双细胞后，我们分析了695,819个细胞的表达谱，每个细胞中位数为2,544个基因和总共17个表面蛋白。
对整合数据集进行无监督聚类和均匀流形近似与投影（UMAP）可视化，识别出17个亚群（图1b，扩展数据图1b和补充表3），主要按刺激条件分离（扩展数据图1c），展现出独特的抗体衍生标签表达模式，用于亚型T细胞标记CD4和CD8、活化T细胞标记CD69和幼稚T细胞标记CD62L（扩展数据图1d），观察到最小的批次效应（扩展数据图1e）。

Para_02

通过使用典型标记物计算细胞周期阶段得分，我们推断出每个细胞的阶段（G1、G2/M或S）（扩展数据图1c）。
基础状态的CAR T细胞被划分为八个亚簇（簇ID：0、2、5、6、8、11、15和16），主要根据其记忆状态或细胞周期状态进行区分（扩展数据图1f,l）。
簇11中一小部分未受刺激的CD8+细胞表现出细胞毒性特征，以GZMA和GZMB的高表达为标志（扩展数据图1k），这可能表明在制造过程中引发的CAR持续性信号传导。
在APC刺激后，大多数细胞表现出CD4+或CD8+类型1（TH1和Tc1）特征，以Il2、IFNG、TNF、CSF2和TBX21的表达升高为标志（扩展数据图1g）。
在簇7中，存在CD4+类型2（TH2）、类型9（TH9）和类型17（TH17）细胞的组合，同时伴有CCL3和CCL4的表达升高（扩展数据图1i,j）。
簇3表现出XCL1和XCL2的表达升高（扩展数据图1j），编码C趋化因子亚家族的蛋白质，这表明CAR T细胞与常规类型1树突状细胞之间的免疫通讯。
调节性T细胞转录因子FOXP3的表达被识别，特别是在簇14中（扩展数据图1h）。
在簇12中，我们识别出一组独特的细胞亚群，以FOS和JUN的表达为标志，形成一个孤立的群体（扩展数据图1m）。
这个簇包含了基础和活化的CAR T细胞。
我们计算了每个簇中所有单细胞的标记基因和细胞蛋白的平均表达水平，生成了一个伪批量热图，进一步证实了我们对CAR T细胞转录组和表面蛋白质组景观的划分（扩展数据图1n,o）。

Grouping patients based on BCA duration

Para_01

我们继续将输注产品的异质性与临床观察结果进行关联，旨在识别超长持久性CAR T细胞背后的机制。
外周血中B细胞发育不全（BCA）的存在已被用作衡量CTL019细胞功能持久性的替代指标，因为6个月内早期B细胞恢复的患者几乎无一例外地会经历复发。
我们CR队列中的患者已实现满意的长期缓解；然而，有八名CR患者表现出可检测到的BCA持续时间少于6个月，这促使其中五名患者在初次给药后半年内再次输注CAR T产品。
在我们队列中，五名CR患者的BCA中位持续时间为8.4年（BCA-L组），在最后一次临床随访时仍保持BCA，这为识别CAR T细胞长寿的分子决定因素提供了独特的机会。
因此，我们根据BCA持续时间将所有患者分为五个持久性组（图1c）。
BCA1代表最短持续时间，少于3个月，包括NR组的所有患者。
大约86%的BCA2和BCA3组患者经历了CD19+或CD19-复发。
BCA-O组的患者在最后一次数据收集时仍持续有BCA，中位持续时间为5.1年。
为了减轻与试验设计相关的潜在混杂变量，42名患者（包括来自NCT01626495的5名BCA-L组患者）被分析为发现队列，而其他40名患者（包括来自NCT02906371的11名BCA-O组患者）构成了验证队列。

Basal CAR T profiles and persistence

Para_01

我们接下来研究了基线CAR T细胞的特征性图谱是否能够区分持久性组。
对静息状态下的CAR T细胞进行聚类分析，解析出11个转录上不同的亚群（扩展数据图2a–c）。
记忆评分，由CCR7、TCF7、Il7R、AQP3、CD27和LTB的表达定义，在簇0和簇4中富集，BCA-L组在簇0和簇4中的细胞比例显著高于BCA2和BCA1（扩展数据图2d）。
增殖标记物（MKI67、TYMS、TOP2A和ASPM）在簇1中富集（扩展数据图2e），而簇3基于GZMA、GZMB、GZMH、GNLY、PRF1和NKG7的表达显示出高CD8+细胞毒性评分（扩展数据图2b,f）。
与其它组相比，BCA-L在这些簇中的细胞比例显著下降。
我们在伪批量水平上定量比较了标记基因的平均表达，揭示了BCA-L和BCA-O CAR T细胞中记忆基因表达增加，细胞毒性、增殖和共抑制基因表达减少（扩展数据图2g）。
表面蛋白分析一致显示CCR7和CD127（由Il7R编码）的表达升高，同时共抑制表面标记物（PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM3和TIGIT）的表达显著降低（扩展数据图2h）。
综合这些数据，指向基线BCA-L细胞中保守的记忆状态、减弱的增殖活性以及微妙的细胞毒性和共抑制特征，表明保持非活跃状态的能力与CAR T细胞的长寿相关。

Type 2 function in long-term responders

Para_01

我们将评估扩展到CD19特异性APC刺激的CAR T细胞，以深入了解其早期免疫激活动力学。
来自发现队列的细胞的UMAP聚类揭示了13个不同的簇（图2a和扩展数据图3a）。
BCA-L组在簇0中表现出显著更高的流行率，占所有细胞的33.8%，并显示出记忆评分的富集表达（扩展数据图3b）。
这表明它们在激活后具有更强的保留中央记忆状态的能力。
一致地，伪批量表面蛋白分析显示，BCA-L和BCA-O细胞中记忆标记CCR7和CD127的表达升高，同时原型凋亡介导因子FAS（也称为CD95和APO-1）的表达降低，而其他组则显示出共抑制标记的表达增加（扩展数据图3c）。

Fig. 2: Elevated type 2 functionality of CAR T products is associated with 8-year ultralong remission.

a–d，对来自发现队列（a）或验证队列（c）的CD19-3T3刺激的CAR T细胞进行无监督聚类分析，以及表面蛋白CD4和CD8的表达分布。展示了发现队列（b）或验证队列（d）UMAP上特定簇中类型1和类型2评分的表达模式和细胞比例比较。
e，使用细胞内流式细胞术评估CD4+CAR+细胞中类型2-细胞因子+群体的频率比较。
f，使用多plex分泌组学检测在32名患者队列中评估类型2细胞因子分泌水平的比较。
g，对来自六名患者的CD19-3T3刺激的CAR T细胞进行整合的ATAC-基因UMAP聚类，发现在簇A3中富集了类型2细胞。展示了簇A3中患者组间的细胞比例比较。
h，GATA3基因区域的伪批量染色质可及性轨迹，分别为每位患者单独绘制。由ENCODE预测的增强子元件以浅黄色突出显示。
i，BCA-L与BCA2或1 CAR T细胞之间的差异基序活性（左）。右图，每位患者中类型2基序MA0037.3（GATA3）和类型1基序MA0690.1（TBX21）的表达谱。FC，倍数变化。
j，基序足迹追踪图显示了两组患者中GATA3转录因子结合动力学及其位置权重矩阵。
k，使用敲低STAT6或GATA3的CAR T细胞在体外重复刺激实验中评估肿瘤细胞裂解效力和CAR T细胞计数。KD，敲低。该图使用BioRender创建。数据为均值±标准误，来自n=48（b），n=46（d），n=42（e），n=32（f）和n=6（g）患者或健康对照，或每个条件n=3技术重复（k）。显著性水平使用双尾Mann–Whitney U检验（b，d，e，f，h和i），双尾未配对Student’s t检验（g）和单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验（k）计算。

Para_02

在簇1中的优势群体（占整个群体的16.5%）显示出富集的类型1评分（IFNG, TNF, CSF2和TBX21），主要由CD8+细胞组成（图2a,b）。
尽管在HD CAR T细胞中的比例较低，但患者BCA组在此簇中显示出无法辨别的统计学差异。
值得注意的是，BCA-L细胞在簇7中显著更为丰富——这是一个由CD4+和CD8+细胞组成的混合群体，具有类型2评分（Il4, Il5, Il13和GATA3）表达的富集（图2a,b）——尽管其在所有单个细胞中的比例相对较低（3.14%）。
定义类型1或类型2评分的基因具有可变的表达分布和水平（扩展数据图3d），突显了使用一组基因来定义表型特征的必要性。
在验证队列中，我们注意到类似的聚类模式，特征在于记忆细胞比例较高，类型1细胞水平相当，而在BCA-O组的5年无复发生存患者中，类型2细胞比例显著增加（图2c,d和扩展数据图3e–g），这表明长期持续CAR T细胞具有一致的分子特征。
在两个队列中，通过CITE-seq表面蛋白分离的CD4+或CD8+细胞的亚聚类分析也发现了长期响应者中类型2特征的这一增加，尽管在所有患者组中CD8+细胞的百分比略低（扩展数据图4a–d）。
定义类型2身份的经典标志物，包括细胞因子、转录因子、趋化因子受体和PTGDR2（编码CRTH2），在来自HD、BCA-L和BCA-O组患者的CD4+和CD8+ CAR T细胞中集体表现出表达升高（扩展数据图4e）。
利用这一大规模单细胞转录组数据集，我们构建了一个分子网络，以说明与来自其他患者的CAR T细胞相比，持久响应者的CAR T细胞中类型2通路的激活（扩展数据图4f）。

Para_03

在BCA-L和BCA-O组患者中识别出增强的2型功能，促使我们进行额外的验证。
通过APC激活的CD4+和CD8+CAR+细胞的细胞内流式细胞术分析，确认BCA-L组中表达IL-3、IL-4、IL-5、IL-13和IL-31的细胞比例显著增加，其显著性水平明显高于持续性较差的BCA1和BCA2组（图2e和扩展数据图5a,b）。
这一趋势在验证队列中基本保持（扩展数据图5c）。
我们还使用了一种独立的多重分泌组学检测方法，测量了32名患者激活后输注产品中的分泌细胞因子（扩展数据图5d）。
分泌指数通过分泌特定细胞因子的细胞频率乘以平均信号强度来量化，用于描述分泌组学能力。
分泌2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和IL-21的CAR T细胞的指数在BCA-L和BCA-O组患者中显著较高（图2f），而IL-10的分泌水平则显示不出明显差异。

Para_04

为了识别与CAR T细胞持久性相关的上游调控因子，我们进行了一种单细胞转座酶可接近染色质（ATAC）和转录组共分析的激活CAR T细胞实验，比较了来自BCA-L组的3名患者与来自BCA2或BCA1组的另3名患者，后者的BCA持续时间少于3个月（补充表4）。
结合ATAC和基因表达谱的整合UMAP分析揭示了十个簇，其中2型细胞在A3簇中富集，显示出在BCA-L组中一致且显著的增量（图2g）。
在GATA3基因组的染色质可接近性信号中，2型T细胞的主要调节因子和典型2型细胞因子基因在每个BCA-L组患者的基因组区域中显著升高（图2h和扩展数据图6a）。
值得注意的是，对于另一个关键的2型调节因子STAT6，在六名患者中观察到了类似的信号（扩展数据图6b）。
与来自完整队列的前转录组聚类结果一致，IFNG和1型调节因子（包括STAT1、STAT4和编码T-bet的TBX21）的可接近性显示出微不足道的差异（扩展数据图6c,d）。

Para_05

我们接下来进行了差异基序分析，以识别开放染色质区域内的潜在转录因子结合位点（图2i）。
在BCA-L CAR T细胞中观察到显著增强的基序结合活性，与BCA2或1细胞相比，GATA3成为最显著差异富集的位点，同时还有其他几个GATA家族成员。
检查每个患者的单细胞基序活性谱，TBX21在所有患者中显示出一致的水平，而GATA3在BCA-L组三名患者的单细胞中显示出显著富集的活性（图2i）。
值得注意的是，STAT6在此分析中并未成为差异基序。
相反，属于IRF家族的转录中介因子在BCA-L CAR T细胞中显示出显著减少，其中IRF4积极参与促进T细胞耗竭和介导细胞代谢受损。
我们利用GATA3、STAT1和TBX21的位置信息，对其结合动态进行了足迹分析，揭示了BCA-L组中GATA3的可及性显著增加（图2j）。
相比之下，其他两个因子在BCA2或1组中显示出相当的水平（扩展数据图6e）。
为了评估STAT6和GATA3在协调2型功能中的相对重要性，使用敲低STAT6或GATA3的CAR T细胞进行了体外重复刺激实验（图2k）。
虽然两种敲低都显著减弱了肿瘤杀伤效力，但GATA3敲低在实验终点时对CAR T细胞数量的影响更为显著，表明其在维持长期持久CAR T细胞中的功能性2型免疫中起核心作用。
总的来说，这些数据表明，BCA-L和BCA-O组患者在长期治疗中观察到的疗效延长与GATA3上调调节的输注产品中2型功能增强有关。

Type 2 CAR T cells regulate dysfunction

Para_01

配体-受体（L-R）对可以通过其同源基因的协同表达来推断细胞间的免疫通信。
为了研究2型功能如何调节CAR T细胞以维持其长寿，我们基于我们单细胞RNA测序数据集中的L-R表达模式检查了细胞-细胞相互作用。
在从第7簇中的2型细胞发出的L-R通信网络中，出现了一个显著的层次结构，其中最高级别的相互作用明确汇聚在第2簇细胞上，占整个群体的13.9%。
涉及2型细胞因子的信号主要被Il2RG、CD53和CSF2RB等受体基因接收，这些基因广泛涉及T细胞的存活、增殖和下游免疫功能，暗示2型CAR T细胞对整个群体具有潜在的调节作用。
此外，我们发现，在大多数已识别的簇中，向第2簇细胞的L-R相互作用主要涉及2型细胞因子。
而且，与其他簇相比，第2簇中检测到对2型配体敏感的受体的最高表达水平，包括Il2RG、CD53、CSF2RB、Il4R和Il3RA。

Fig. 3: Type 2 CAR T cells regulate dysfunctional subpopulation.

识别来自富含类型2的簇7细胞的左-右相互作用，主要指向簇2。
识别靶向簇2细胞的左-右相互作用。
类型2受体基因的表达谱。
特定于簇2细胞的差异表达基因（DEGs），以及细胞毒性评分的表达模式。定义此模块的基因包括GZMA、GZMB、GZMH、GNLY、PRF1和NKG7。
由簇2中识别的DEGs调控的信号通路。
每个簇内共抑制相关基因或蛋白的伪批量平均表达。
增殖评分的表达模式。
簇2中细胞比例的比较。
实验示意图，用于评估IL-4补充对短期BCA2组患者的CAR T细胞功能谱的影响。该图使用BioRender创建。
添加和不添加10 ng ml−1 IL-4的CAR T细胞的UMAP聚类分析。
特定簇中细胞比例的比较。
在原始和10 ng ml−1 IL-4条件下，BCA-L组患者的CAR T细胞与BCA2组六名患者的调控通路比较。对于e和l，z > 0，激活/上调；z < 0，抑制/下调；z ≥ 2或z ≤ −2，显著。数据为n = 48（h）和n = 6（k）患者或健康供体的平均值 ± 标准误差。显著性水平使用双尾Mann-Whitney U检验（d和h）、右尾Fisher精确检验（e）或双尾Wilcoxon配对符号秩检验（k）计算。

Para_02

为了描绘簇2细胞的独特特征，我们进行了差异表达基因（DEGs）的分析，发现细胞溶解效应基因GNLY和GZMA的表达显著增加（图3d），同时伴随着细胞毒性评分的集中分布，表明其具有高度细胞溶解表型。
此外，Il32基因（特异性表达于经历凋亡的T细胞）23和CALM1基因（有助于T细胞耗竭途径）24在该簇中显著上调。
相反，这些细胞在很大程度上丧失了细胞因子生产能力，表现为IFNG、CSF2、Il2、Il3、Il5、Il13、XCL1/2和CCL3/4的显著下调。
一致地，通路分析显示，对T细胞激活和功能至关重要的通路，包括mTOR、PI3K–AKT和JAK–STAT信号通路25，受到了显著抑制（图3e）。
同时，凋亡信号通路、MYC介导的凋亡、T细胞耗竭信号通路和钙诱导的T淋巴细胞凋亡被共同触发，表明这些细胞可能由于过度产生细胞毒性而表现出终末效应器特征。
在该簇中，我们还观察到共抑制基因和蛋白质的高表达，特别是TIM3及其编码基因HAVCR2（图3f），并且在属于簇2的23,608个单细胞中，细胞毒性评分与共抑制评分（PDCD1、CTLA4、LAG3、HAVCR2和TIGIT）之间存在显著正相关（扩展数据图7a）。
此外，细胞周期蛋白和细胞周期调控在该簇中显著抑制，细胞表现出极低的增殖评分（MKI67、TYMS、TOP2A和ASPM）（图3e,g），表明其增殖能力减弱。
这些数据指向簇2细胞处于晚期分化功能失调状态26；值得注意的是，该簇中BCA-L组的细胞比例显著低于短期BCA组（图3h）。
即使在该功能失调簇中，BCA-L细胞也表现出共抑制评分和共抑制抗体衍生标签（蛋白质）评分（PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM3和TIGIT）的显著降低（扩展数据图7b），暗示增强的2型功能可能缓解CAR T细胞功能障碍。
所有这些分析也在验证队列中进行，通过观察BCA-O组患者的表现，确认了2型细胞的调节效应（扩展数据图7c–j）。

Para_03

我们接下来进行了体外功能研究，以评估在CAR特异性激活期间补充类型2细胞因子的影响（扩展数据图8a）。
首先，使用健康供体的CAR T细胞来确定优化浓度，旨在减轻功能障碍，同时最小化对类型1功能的干扰。
添加10 ng ml−1的IL-4显著增加了增殖簇中的细胞比例，减少了功能障碍的细胞毒性簇，并且对类型1 CAR T富集簇的影响可以忽略不计（扩展数据图8b–e）。
相比之下，更高浓度（20 ng ml−1和50 ng ml−1）导致类型1 CAR T细胞百分比显著降低。
在所有IL-4浓度下，对类型2簇没有观察到统计学上的显著影响。
因此，确定10 ng ml−1的浓度为本研究的最优剂量。
值得注意的是，引入10 ng ml−1的IL-5或IL-13并未减轻功能障碍，尽管增殖簇显著增加（扩展数据图8f–k），这可能需要进一步研究以优化剂量。

Para_04

随后，我们在来自BCA2组的六位患者的CAR T细胞刺激过程中，提供了10 ng ml−1的IL-4（图3i），所有这些细胞均来自我们的发现队列，并保持了大约3个月的BCA持续时间。
无监督聚类分析显示，在添加IL-4后，患者CAR T细胞的增殖能力（聚类1）显著增强，功能失调的细胞毒性（聚类4）得到缓解，在这两个聚类中观察到相应受体基因的表达明显富集（图3j,k和扩展数据图9a–d）。
添加IL-4对它们的1型和2型功能影响最小。
增强2型免疫的优势得到了证实，如信号通路图谱所示，包括代谢活动的上调、功能性免疫程序和细胞增殖的增加，以及与原始条件相比，经10 ng ml−1 IL-4处理的患者的CAR T细胞中凋亡的下调（扩展数据图9e）。
在排除功能失调的聚类4细胞后，观察到功能性通路的上调水平显著下降，同时完全失去了凋亡的下调。
此外，补充IL-4后的短期BCA2 CAR T细胞的功能图谱显示出与BCA-L CAR T细胞相似的模式，特别是在2型通路、氧化磷酸化（OXPHOS）代谢、PI3K–AKT信号、凋亡信号、1型通路、mTOR信号和细胞周期调控方面（图3l）。

Para_05

我们进一步评估了在BCA2或1组的3名患者中，CAR T细胞激活后添加10 ng ml−1 IL-4的染色质可及性改变。
差异可及性峰活性分析揭示了这些持久性较差的细胞在IL-4治疗后发生了功能性重编程，显著上调了1型标记IFNG、2型标记Il13、趋化因子XCL1和XCL2、细胞毒性标记GNLY和NKG7，以及激活/增殖标记VIM27和CD7028（扩展数据图10a,b）。
值得注意的是，CSF2（一种对T细胞功能活动有深远影响的关键免疫调节因子）的可及性显示出最高水平的上调，而标记激活诱导细胞死亡的Il32活性在IL-4补充条件下显著下调（扩展数据图10c）。
这些趋势在每个患者中均一致观察到，并得到了染色质可及性信号轨迹的支持。
整体功能适应性的改善，得益于1型（STAT1）和2型（GATA3）主调节因子增强的基序结合（扩展数据图10d），这可以归因于2型细胞因子对功能障碍群体的有效调节。
综上所述，这些结果确立了2型功能在调节功能障碍的CAR T细胞亚群中的关键作用，从而维持整个CAR T细胞群体的平衡功能稳态和最佳适应性。

Type 2 cytokines in post-treatment sera

Para_01

为了研究患者在CAR T输注后的反应，我们进行了全面的蛋白质组学分析，以测量33名患者（包括BCA-L组的4名患者）在我们发现队列中的治疗后的血清蛋白，以及验证队列中8名患者（包括BCA-O组的3名患者）的血清蛋白（图4a）。
在两个队列中，长期BCA-L和BCA-O患者的2型细胞因子水平显著高于其对照组，尤其是IL-13（图4b和扩展数据图11a）。
相比之下，长期反应者和其他患者之间1型细胞因子和选定趋化因子的纵向水平未观察到显著变化（扩展数据图11b,c）。
在连续时间点的统计分析中，BCA-L组患者在基线测量期间（CTL019输注前0至2天）的2型细胞因子水平显著较高（图4c）。
这种情况促成了一个富含2型细胞因子的环境，以激发细胞动力学，从而为BCA-L细胞带来平衡反应。
在输注初期（第1至5天），未观察到显著差异，这可能是由于CTL019细胞在周围血液、骨髓和其他组织中分散导致的循环细胞暂时减少。
从快速扩张期（第6至8天）到输注后2个月，BCA-L组患者的循环2型细胞因子水平持续且显著升高（图4c）。
在所有调查的时间框架内，1型细胞因子未观察到统计学差异（扩展数据图11d）。
在验证队列中进行了类似分析，证实了在第7、10、14和28天2型细胞因子水平的显著升高，而1型细胞因子水平在BCA组之间保持相当（扩展数据图11e,f）。
我们还检查了血清蛋白质组学特征是否能够反映不同患者在CAR T治疗后内在免疫反应的变化。
基于我们面板中检测到的30种细胞因子的值，对发现队列中的345个血清样本进行了UMAP聚类分析。
该分析解决了5个子集，BCA-L特征在簇2中富集，显示出IL-13和IL-4的表达显著高于其他簇（图4d,e）。
综合这些数据，验证了长期BCA-L和BCA-O患者治疗后血清中2型循环细胞因子水平升高——这一模式可以通过无监督分析识别。

Fig. 4: Long-term responders exhibit higher type 2 cytokine levels in post-treatment sera.

a, 用于测量发现队列中33名患者和验证队列中8名患者血清蛋白的串联蛋白质组学分析示意图。时间点相对于CTL019细胞首次输注日（第0天）。该图使用BioRender创建。
b, 发现队列中患者的2型细胞因子纵向水平。BCA-L组的四名患者（带有患者ID）分别用彩色线条标记。
c, 比较发现队列中持续组在多个时间点的平均2型细胞因子水平。该值为IL-4、IL-5和IL-13的平均表达水平。数据为均值±标准误，来自n=45（基线）、n=54（第1-5天）、n=38（第6-8天）、n=35（第9-11天）、n=36（第12-15天）、n=32（第16-19天）、n=32（第20-23天）、n=54（第25-35天）和n=18（第36-63天）的测量值。显著性水平通过双尾Mann–Whitney U检验计算。
d, 对发现队列中33名患者的345个血清样本测量值进行无监督聚类分析，按聚类ID或BCA反应分组。每个点代表每个时间点单个患者的一次测量值。聚类2在BCA-L患者中表现出富集。
e, 定义每个聚类的差异表达蛋白。星号突出显示具有显著表达水平的2型细胞因子。

Type 2high CAR T cells sustain tumour killing

Para_01

鉴于在超长持久性CAR T细胞中观察到较高的2型免疫，我们接下来研究了2型高CAR T细胞是否能在体内引发增强的抗肿瘤效果。
通过对6名健康供体的单细胞RNA测序数据的聚类分析，我们确定ND463为2型高，ND585为2型低，这是根据2型富集簇6中的细胞比例来确定的（扩展数据图12a–d）。
在这两组之间，未观察到1型评分基因表达有显著差异（扩展数据图12e）。
尽管预期2型高CAR T细胞中CD4+亚型的比例较高，但流式细胞术分析显示CAR转导效率、记忆标记和共抑制标记的表达相当（扩展数据图12f–h）。

Para_02

NSG小鼠通过静脉注射1 × 10^6个Nalm6细胞，用于建立人类白血病模型。
7天后，小鼠被随机分为三组，通过尾静脉输注分别接受2 × 10^6个CAR T细胞或PBS（对照组）（图5a）。
在整个实验过程中，接受治疗的小鼠体重保持稳定（扩展数据图13a）。
无论是2型高表达还是2型低表达的CAR T细胞，都表现出显著降低肿瘤负荷的效果，体现在2周内肿瘤细胞的完全清除（扩展数据图13b）。
然而，流式细胞术分析显示，2型高表达的CAR T细胞产品在体内具有显著优越的扩增能力，外周血中绝对CAR+细胞计数在第八天和第十二天至少比2型低表达组高十倍（图5b）。
为了模拟肿瘤细胞复发，在第十七天给小鼠再次注射1 × 10^6个Nalm6细胞。
值得注意的是，2型高表达的CAR T细胞在白血病再次挑战后表现出强烈的回忆反应能力（图5c），显著延长了荷瘤小鼠的生存期，与其对照组相比（图5d）。

Fig. 5: Type 2high CAR T cells demonstrate enhanced antitumour activity after leukaemia rechallenge.

a, 体内白血病模型示意图，使用类型2低（ND585）或类型2高（ND463）CAR T细胞进行治疗。NSG小鼠经静脉注射1 × 10^6 Nalm6细胞。然后，7天后，小鼠被随机分配到三组，并经静脉输注2 × 10^6 CAR T细胞或PBS（对照组）。存活的小鼠在CAR T输注后17天再次接受1 × 10^6 Nalm6细胞的挑战。该图使用BioRender创建。
b, 在Nalm6负荷小鼠的外周血中，CAR T细胞的扩增在不同时间点进行测量。
c, 肿瘤负担（总通量）在CAR T治疗后的小鼠中，以每秒光子数进行量化。
d, 小鼠生存的Kaplan–Meyer分析。数据为每组n = 5只小鼠的平均值 ± 标准误（b和c）。显著性水平通过双尾未配对Student’s t检验（b和c）或log-rank Mantel–Cox检验（d）计算得出。

Para_03

为了阐明2型高表达CAR T细胞在体内增强抗肿瘤效力的机制，我们在CAR活性高峰的第8天评估了其功能特性。
尽管中枢记忆标志物的水平相似（扩展数据图13c），2型高表达CAR T细胞显示出共抑制标志物的表达降低，包括PD-1、TIM3、LAG-3和KLRG1。
相反，在2型低表达CAR T细胞中，凋亡介导因子FAS的水平显著较高（扩展数据图13d）。
我们还发现，在2型高表达治疗组中，IFNγ的表达显著增加，这表明制造出的CAR T产品中2型成分的增加并不妨碍1型反应（扩展数据图13e）。
GZMB和TNF的表达没有统计学差异。
在初始消除白血病细胞后，2型高表达CAR T细胞获得了有利的记忆表型，表现为第12天CD27和CD45RO的表达显著增加。
CD27表达的重要性在第16天进一步增强（扩展数据图13f）。
此外，LAG-3和KLRG1在两个时间点都保持了显著降低的表达（扩展数据图13g）。

Para_04

为进一步确认2型细胞群体在观察到的优异反应中的功能作用，我们根据CCR3和CCR432的表面标记表达，从2型高表达的CAR T样本中分离出2型细胞，并与Nalm6细胞进行体外共培养，为期4天，效应细胞/靶细胞（E/T）比例为1:4（扩展数据图13h）。
排除这一群体显著削弱了抗肿瘤能力，导致在杀伤实验结束时CAR T细胞绝对数量的减少（扩展数据图13i）。
表型分析显示，2型分离组中协同抑制信号增强，1型功能减弱，记忆状态下降（扩展数据图13j）。
这种脆弱性在移除2型细胞后补充10 ng ml−1的IL-4得以部分缓解。
值得注意的是，添加IL-4进一步增加了原始2型高表达CAR T细胞的数量。
这些数据与我们之前在长期BCA-L CAR T细胞的单细胞RNA测序分析中的观察结果一致，表明体内2型功能的提升有效减少了耗竭，并保留了CAR T细胞的中枢记忆状态，这可能与其在再挑战环境中优异且持久的治疗活性相关。

Type 2low CAR T cells can be revitalized

Para_01

我们接下来研究了是否增强2型功能可以提高2型低表达CAR T样本（ND585）的性能，采用了两种策略：（1）在输注前用2型细胞因子预处理CAR T产品；（2）从单采T细胞开始，将2型细胞因子纳入制造过程（图6a）。
与所有先前的研究一致，使用10 ng ml−1的IL-4来预处理ND585 CAR T产品，从而得到预处理的CAR T细胞。
在ND585 T细胞的新制造过程中评估了两种不同的IL-4剂量，即10 ng ml−1或50 ng ml−1，分别生成增强型2型CAR T细胞，称为ET2-L CAR T细胞或ET2-H CAR T细胞。
与补充IL-7和IL-15的常规条件相比，加入IL-4对CAR T细胞的扩增、活性和大小没有明显影响，除了预期的CD4百分比增加（扩展数据图14a,b）。

Fig. 6: Revitalizing type 2low CAR T cells through enhanced type 2 functionality boost.

a, 示意图展示了两种策略，用于增强来自供体ND585的2型低表达CAR T细胞的2型功能。该图使用BioRender创建。
b, 使用生物发光在指定天数后测量肿瘤负担。GVHD，移植物抗宿主病。
c, 在Nalm6荷瘤小鼠的外周血中，在输注后不同时间点测量CAR T细胞的扩增情况。数据为每组n=5只小鼠的平均值±标准误。
d, 小鼠生存的Kaplan–Meyer分析。显著性水平通过单因素方差分析及Tukey多重比较检验（c）或log-rank Mantel–Cox检验（d）计算。

Para_02

所有新产生的CAR T细胞被注射到携带Nalm6细胞的NSG小鼠体内（扩展数据图14c），并与来自同一供体的原始2low型CAR T细胞的疗效进行了比较。
虽然所有治疗组在1周内都成功清除了肿瘤负担，但只有经过预处理的CAR T细胞和ET2-L/H CAR T细胞显示出完全排斥相同数量肿瘤细胞再挑战的能力（图6b和扩展数据图14d），突显了通过增强2型功能在CAR T细胞治疗中的治疗潜力。
在CAR T细胞输注后不同时间点的流式细胞术分析显示，新产品的外周血中CAR+细胞显著扩增（图6c），同时伴随共抑制标志物表达的显著降低和第8天高峰时IFNγ产生的增加（扩展数据图14e,f）。
这可能与它们在显著延长生存期方面的优越能力相关（图6d）。
值得注意的是，这些策略并未改变2型特征（扩展数据图14g）。
为了严格评估这两种策略的使用，我们在第42天启动了第二次肿瘤再挑战，模拟相对晚期的复发。
在第三次肿瘤细胞注射后，ET2-L和ET2-H CAR T细胞均表现出强大的肿瘤控制能力，优于接受预处理CAR T细胞治疗的组（图6b,d）。

Para_03

最终，我们实施了启动策略来修饰来自BCA2组（DC80）的一名患者的CAR T细胞，该患者在发展为CD19+复发前表现出3个月的BCA持续时间。
在重复刺激实验的最初4天中，原始的以及10 ng ml−1 IL-4启动的DC80 CAR T细胞与Nalm6细胞以1:2的E/T比例共培养，均表现出强大的肿瘤杀伤能力，达到近100%的效率（扩展数据图14h）。
与体内结果相似，启动的CAR T组在此期间CAR T细胞数量显著增加，并显示出显著增强的记忆特征，减少的共抑制标记，以及在第四天IL-2、IFNγ、GZMB、Ki-67和IL-13的表达增强（扩展数据图14i）。
我们逐渐将E/T比例降低到第8天的1:16，导致原始DC80 CAR T细胞的肿瘤杀伤能力几乎完全丧失。
然而，IL-4启动的DC80 CAR T细胞保留了大约50%的活性，这可能是由于它们保留了记忆状态，显著提高了功能性细胞因子的产生和第9天的增殖（扩展数据图14j）。
值得注意的是，原始BCA2细胞在共抑制分子的表达上显著减少，这表明这些细胞可能已经达到一种不再容易被激活以执行肿瘤细胞杀伤的状态。
综合来看，这些发现表明增强2型功能有望重振2型低CAR T细胞，特别是通过改进的制造工艺纳入2型细胞因子。

Discussion

Para_01

尽管样本量有限，我们最近的研究发现，与持久响应者相比，CD19+复发患者的TH2细胞存在缺陷。
在扩大的临床队列中，2型功能在维持CAR T细胞长寿方面的关键贡献变得更加显著。
早期使用人类抗原特异性T细胞克隆的研究表明，IL-4促进了CD4+和CD8+ T细胞克隆的生长。
此外，IL-4通过上调BCL2和BCL-xL的表达来帮助T细胞存活，同时下调FAS受体的表达和caspase 3的活性，这是程序性细胞死亡中的关键执行酶。
为了阐明2型功能如何影响CAR T细胞的长寿，我们通过L–R分析解析了复杂的机制，并发现，在强烈的相互作用中，2型富集的细胞簇主要调节一群功能失调的细胞，这些细胞表现出细胞毒性过度激活、HAVCR2和TIM3高表达、免疫功能受损和增殖减弱。
值得注意的是，染色质可及性分析和体外功能测定均显示，增强2型功能显著提升了仅获得短期响应的患者的CAR T细胞，改善了包括1型功能、细胞毒性、增殖和存活在内的各个方面。
这种改善甚至诱导了转录状态的逆转，类似于BCA-L CAR T细胞，这可能是由于对功能失调细胞的调节。
这些发现表明，2型CAR T细胞的存在通过在早期抑制过度活跃的细胞毒性和减轻不可逆的耗竭，维持了整个群体的稳态，从而增强了它们的持久性和适应性。

Para_02

利用这些见解来改进未来的CAR T制造实践至关重要。
我们提出了并评估了两种策略来应对这一问题，考虑了两种情况：（1）在整个制造过程中向培养基中添加IL-4，适用于尚未生成的产品；以及（2）如果重新制造在实用临床应用中不可行，则用IL-4预处理CAR T产品。
通过使用白血病小鼠模型的严格体内研究，随访超过100天，并进行了两次肿瘤再挑战，两种方法都被证明在增强2型低CAR T细胞的抗肿瘤反应方面非常有效。
然而，用于临床患者治疗的2型功能最佳水平仍有待进一步研究。
我们的scRNA-seq数据显示，BCA-L CAR T产品中平均有8%的2型细胞，而短期对照产品中不到2%。
虽然这些发现可以作为潜在的阈值，但需要更彻底的评估来建立将2型功能应用于CAR T细胞疗法的临床标准。

Para_03

总之，我们从大量患者队列中获得的大规模单细胞多组学数据集，为理解CAR T细胞长寿的分子决定因素提供了宝贵见解。
我们的发现强调了2型功能在介导整个CAR T细胞群体内1型和2型稳态平衡状态中的作用，从而导致了超长寿命和适应性。
基于此，我们提出了几种治疗策略，这些策略得到了动物模型中临床前体内数据的支持，以增强CAR T细胞输注产品中的2型功能，以减轻功能障碍，最终延长对CAR T细胞疗法的反应持久性。

Methods

Samples from paediatric patients with ALL and HDs

来自儿科急性淋巴细胞白血病(ALL)和霍奇金淋巴瘤(HDs)患者的样本

Para_01

当前研究是一项二次调查，使用了宾夕法尼亚大学机构审查委员会提供见解的现有临床试验中收集的患者样本。
从参与I/IIA期临床试验的患者中获取了CAR T细胞输注前的样本，该试验旨在评估CTL019 T细胞治疗的安全性和可行性（ClinicalTrials.gov: NCT01626495），或参与一项关注优化托珠单抗给药时间以管理CART19治疗相关细胞因子释放综合征的试点研究（ClinicalTrials.gov: NCT02906371）。
这两项试验均在费城儿童医院和宾夕法尼亚大学联合进行。
在参与之前，患者或其监护人根据赫尔辛基宣言中概述的原则提供了书面知情同意。
实验室程序严格遵循国际协调会议制定的良好临床实践指南，采用标准化的操作程序和协议进行样本的接收、处理、冷冻和分析。
在整个研究中严格遵循了严格的伦理规定。
健康供体的原发性T淋巴细胞由宾夕法尼亚大学人类免疫学核心提供。
为确保符合HIPAA法规，所有样本在分析前均进行了去标识化处理。

Generation of CTL019 cells

CTL019细胞的生成

Para_01

自体外周血单核细胞通过标准白细胞分离术收集。
随后通过单核细胞淘洗法富集T细胞，并进行彻底洗涤和利用抗CD3/CD28包被的顺磁性微珠进行激活。
构建了一种携带先前描述的CD19特异性嵌合抗原受体（CAR）及4-1BB/CD3ζ转基因的慢病毒载体，
在激活阶段使用该载体转导细胞，并在培养开始后3天将其洗脱。
细胞扩增通过使用摇动平台（WAVE生物反应器系统）进行，持续8至12天，之后磁性去除微珠。
最后，收集CTL019细胞并进行冷冻保存以备将来使用。

Generation of human-CD19-expressing NIH/3T3 cell line

人CD19表达型NIH/3T3细胞系的生成

Para_01

我们使用小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞开发了人工抗原呈递细胞（APCs），以激活针对相应抗原的CAR T细胞。
NIH/3T3细胞系最初从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取，并在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco，16000044）的DMEM培养基（Gibco，11995-065）中培养，置于37°C、5% CO2的湿润培养箱中。
当细胞达到约80%汇合度时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，25200056）从培养瓶中分离细胞，并用编码人CD19的慢病毒载体进行转导。
转导后3天，1 × 10^6个细胞用特异性抗体标记转导的表位，并使用FACSAria（BD）分选仪进行分选，以在引入转基因后达到超过99%的纯度。
在基因修饰前后，进行了常规的支原体污染筛查和鉴定。
随后，选择稳定表达的克隆进行T25或T75培养瓶的扩增，并冷冻保存以备将来使用。

In vitro co-culture assay

体外共培养实验

Para_01

CTL019细胞被解冻并在OpTmizer T-Cell Expansion Basal Medium（Thermo Fisher Scientific, A1048501）中培养，该培养基补充了GlutaMAX Supplement（Thermo Fisher Scientific, 35050061）和5%人血清AB（Gemini Bioproducts, GEM100-512），在湿化培养箱中进行第一天的初始过夜休息。
在第二天，使用Dead Cell Removal Kit（Miltenyi Biotec, 130-090-101）根据制造商的说明去除死细胞，并在开始共培养实验前使用血细胞计数器对特定数量的细胞进行计数。
为了与CD19-3T3细胞（APC细胞）进行刺激，将1 × 10^6个CTL019细胞与等量的APC细胞在2毫升培养基中混合；对于未刺激条件的评估，准备了1 × 10^6个细胞。
所有悬浮液均在RPMI培养基（Gibco, 11875-119）中培养，该培养基补充了10% FBS，并在组织培养处理的24孔板（Thermo Fisher Scientific）中在培养箱中培养12小时。
为了评估CAR T细胞群体对2型细胞因子的反应的功能实验，将重组人IL-4、IL-5或IL-13（R&D Systems, 204-IL-010, 205-IL-010, 213-ILB-010，分别）按指定浓度添加到培养基中。
共培养后，通过剧烈的吸液操作收集细胞，并将细胞悬浮液通过20微米滤网以去除团块，然后使用PE标记的单克隆抗FMC63单链可变片段（scFv）抗体（CAR19）（Y45, ACRO Biosystems, FM3-HPY53）在4°C下染色1小时。
随后，细胞被标记上抗PE MicroBeads UltraPure（Miltenyi Biotec, 130-105-639），并加载到置于MACS分离器磁场中的MACS柱上。
在柱内磁性保留的CAR+细胞被分离为阳性选择的组分，而未转导的CAR−细胞则流过。

Sample hashing and staining with DNA-barcoded antibodies for CITE-seq

使用DNA条形码抗体进行CITE-seq的样本哈希和染色

Para_01

我们使用了标签试剂进行样本条形码编码，使得可以将八个样本合并到单个泳道中，以便在后续分析中进行解复用。
具体来说，对于人类样本，标签由两种抗体组成，这两种抗体识别普遍存在的表面标记CD298和β2微球蛋白，每种抗体都与含有条形码序列的相同寡核苷酸结合。
从上一步骤中获得的磁性选择的CAR+细胞，来自四名个体，以及每个个体对应的基线未刺激的CAR T细胞，使用5 µl的人类TruStain FcX Fc阻断试剂（BioLegend, 422302）进行阻断。
随后，它们与1 µl（0.5 µg）的相应TotalSeq-B抗人标签抗体1-9（BioLegend）在4°C下孵育30分钟。
染色后，样本用500 µl的细胞染色缓冲液（BioLegend, 420201）洗涤两次，并汇集到单个试管中。
然后将合并的细胞在抗体鸡尾酒中孵育，该鸡尾酒包含每种TotalSeq-B抗人抗体（BioLegend）2 µl（1 µg），按照制造商的协议进行。
该面板包括一系列针对各种细胞表面标记的抗体，包括CD4（RPA-T4, 300565）、CD8（SK1, 344757）、CD45RA（HI100, 304161）、CD45RO（UCHL1, 304257）、CD62L（DREG-56, 304849）、FAS（DX2, 305653）、CD127（A019D5, 351354）、CD28（G043H7, 302961）、CD27（O323, 302851）、CCR7（G043H7, 353249）、HLA-DR（L243, 307661）、CD69（FN50, 310949）、PD-1（EH12.2H7, 329961）、TIM3（F38-2E2, 345053）、LAG-3（11C3C65, 369337）、CTLA-4（BNI3, 369629）和TIGIT（A15153G, 372727）。

scRNA-seq library preparation and sequencing

单细胞RNA测序文库制备和测序

Para_01

单细胞RNA测序（scRNA-seq）文库使用Chromium单细胞3′文库和凝胶珠试剂盒v3.1（10x Genomics，PN-1000268）制备。
最初，20,000个TotalSeq抗体染色的CAR T细胞悬浮在含有0.04%牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich，A7030）的PBS（Gibco，14190-144）缓冲液中，并加载到Chromium Next GEM芯片G上，细胞和唯一条形码的珠子被分区到纳升级别的凝胶珠-乳液（GEMs）中。
在每个GEM内，细胞发生裂解，随后释放的mRNA进行逆转录，并通过PCR对条形码互补DNA进行12个循环的分离和扩增。
随后，使用0.6× SPRI珠（Beckman Coulter）纯化在cDNA反应中分离hashtag/表面蛋白寡核苷酸衍生的cDNAs（<200 bp）和mRNA衍生的cDNAs（>300 bp）。
在片段化、末端修复和poly(A)加尾后，样本索引被整合，并进行扩增。
最终文库在Illumina NovaSeq 6000测序系统上进行测序前进行了质量控制检查，采用150 bp长度的双端读数。
三个样本按8:1的基因和hashtag/表面蛋白文库混合比例，每800G流动池合并并测序。

scATAC and gene co-profiling library preparation and sequencing

scATAC和基因共分析文库制备及测序

Para_01

使用Chromium Next GEM单细胞多组学ATAC + 基因表达试剂盒（10x Genomics，PN-1000283）对同一单个细胞核的表观基因组景观和基因表达进行了单细胞共分析。
最初，来自6名患者的经CD19-3T3刺激的CAR+细胞，在有或没有10 ng ml−1 IL-4补充的情况下，进行了洗涤、计数和细胞核分离，优化了3分钟的裂解时间。
随后，分离的细胞核悬浮液在含有转座酶的转座混合物中孵育，促进了开放染色质区域DNA的优先片段化。
同时，适配器序列被引入到DNA片段的末端。
大约9,250个细胞核随后被加载到Chromium Next GEM芯片J上，以目标最终回收约6,000个细胞核。
在GEM生成过程中，凝胶珠引入了poly(dT)序列，该序列能够从mRNA生产带有条形码的全长cDNA用于基因表达分析，以及一个间隔序列，便于条形码附着到转座的DNA片段上进行ATAC分析。
GEM孵育、纯化和预扩增PCR后，使用标准协议构建了独立的ATAC和基因文库。
经过质量评估后，两个文库在Illumina NovaSeq 6000测序系统上进行了150 bp读长的双端测序，ATAC文库每个细胞核的平均深度为24,305个读对，基因文库每个细胞核的平均深度为13,756个读对。

Intracellular cytokine detection assay for CD19-3T3-stimulated patient CAR T cells

CD19-3T3刺激的患者CAR T细胞内细胞因子检测实验

Para_01

共培养的细胞经过一系列免疫染色的处理步骤。
首先，它们用PBS洗涤两次，然后在室温下用Live Dead Blue检测试剂（Thermo Fisher Scientific, L34962）染色20分钟，该试剂用PBS稀释至1:800，以评估细胞活力。
接下来，细胞用FACS染色缓冲液洗涤两次，然后在室温下对表面分子进行染色20分钟。
为了固定染色细胞，使用Cytofix/CytoPerm固定/透化试剂盒（BD Biosciences, 554714）在室温下处理20分钟，同时避光。
随后，细胞用1×透化/洗涤缓冲液洗涤两次，然后用透化/洗涤缓冲液中的抗体对CAR19和细胞内细胞因子进行染色。
这一染色过程在室温下避光进行20分钟。
细胞随后用透化/洗涤缓冲液再洗涤两次，然后重悬于FACS染色缓冲液中以备后续分析。
以下抗原使用指定的抗体克隆进行染色：抗FMC63 scFv（Y45, ACRO Biosystems, FM3-HPY53）、CD3（SK7, BD Biosciences, 564001）、CD4（OKT4, BioLegend, 317442）、CD8a（RPA-T8, BioLegend, 301042）、CD19（HIB19, BD Biosciences, 561121）、CD14（M5E2, BD Biosciences, 561391）、IL-3（BVD3-1F9, BioLegend, 500606）、IL-4（MP4-25D2, BioLegend, 500834）、IL-5（TRFK5, BioLegend, 504306）、IL-13（JES10-5A2, BioLegend, 501916）和IL-31（1D10B31, BioLegend, 659608）。
细胞表面抗体在染色过程中使用1:100稀释，细胞内抗体使用1:50稀释。
样品在Cytek Aurora流式细胞仪上进行分析，数据分析使用FlowJo v.10.8.0软件进行。

Multiplexed secretomic assay

多重分泌组学检测

Para_01

在用CD19-3T3细胞刺激后，约30,000个磁性富集的CAR+细胞被处理用于膜染色（IsoPlexis, STAIN-1001-1）。
随后，这些细胞被加载到IsoCode芯片上（IsoPlexis, ISOCODE-1001-4），该芯片包含12,000个预图案化的腔室，每个腔室配备32种细胞因子捕获抗体阵列。
芯片进一步在IsoLight机器中孵育16小时，温度为37°C，补充5% CO2。
然后应用检测抗体混合物以检测分泌的细胞因子，并进行荧光标记。
生成的荧光信号使用IsoSpeak v.2.8.1.0（IsoPlexis）进行分析，以确定特定细胞因子分泌细胞的数量及每种细胞因子的强度水平。
为了下游分析，提取了与类型2相关细胞因子相关的原始数据，包括IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13和IL-21。

Generation of STAT6 and GATA3 knockdown CAR T cells

STAT6和GATA3敲低CAR-T细胞的生成

Para_01

为了生成STAT6和GATA3敲低CAR T细胞，首先在HEK293T细胞中生产含有针对STAT6（shSTAT6）和shGATA3的短发夹RNA的逆转录病毒颗粒。
这些细胞系最初从ATCC获得，并经检测未发现支原体污染。
这些细胞通过钙磷酸盐转染法转染了编码pCMV-VSV-G（Addgene, 8454）、pCMV-dR8.2 dvpr（Addgene, 8455）以及pLKO.1-puro_shSTAT6（pLKO.1-puro, Addgene, 8453）或pLKO.1-puro_shGATA3的质粒。
随后，CAR T细胞在连续两天内通过离心转导法与shSTAT6或shGATA3逆转录病毒颗粒进行转导，以确保高效转导。
shSTAT6或shGATA3序列的池如下：

Para_02

shSTAT6-1: 5′-CCGGAGCGGCTCTATGTCGACTTTCCTCGAGGAAAGTCGACATAGAGCCGCTTTTTTG-3′; shSTAT6-2: 5′-CCGGAGCACCCTTGAGAGCATATATCTCGAGATATATGCTCTCAAGGGTGCTTTTTTG-3′; shGATA3-1: 5′-CCGGAGCCTAAACGCGATGGATATACTCGAGTATATCCATCGCGTTTAGGCTTTTTTG-3′; shGATA3-2: 5′-CCGGCCCAAGAACAGCTCGTTTAACCTCGAGGTTAAACGAGCTGTTCTTGGGTTTTTG-3′。
The resulting CAR T cells were expanded for an additional 2 days before use.
The knockdown efficiency was assessed at both the gene and protein expression levels to confirm the efficacy of STAT6 and GATA3 silencing.

Serial proteomic profiling of patient serum samples

患者血清样本的串联蛋白质组学分析

Para_01

Cytokine Human Magnetic 30-Plex Panel (Invitrogen, LHC6003M) 用于检测我们探索队列中33名患者的血清蛋白。
血清样本在−80 °C下冷冻保存，时间跨度从CTL019输注前2天到输注后63天，按照制造商的协议解冻并进行分析。
测量使用FlexMAP 3D仪器（Luminex）进行，数据采集和分析使用xPONENT软件（Luminex）完成。
此外，Olink Explore 384面板（Olink Proteomics）用于测量我们验证队列中八名患者的血清蛋白，所有蛋白数据以log2尺度上的标准化表达值报告。
在探索队列中，血清收集可能在给定时间框架内对不同患者在不同天进行。
在验证队列中，血清收集对所有患者在指定天数内一致进行。

Mice and tumour cell lines

小鼠和肿瘤细胞系

Para_01

NOD/SCID/IL-2Rγnull (NSG) 小鼠（6周龄）从Charles River Laboratory购得。
所有小鼠均饲养在EPFL的表型基因组学中心（CPG）动物设施中，置于单独通风的笼子里，温度控制在19–23 °C，湿度为45–65%，并保持在12小时黑暗-12小时光照的循环中。
所有涉及小鼠的实验程序均经瑞士当局（沃州，动物协议ID 3533）伦理批准，并遵守EPFL CPG制定的指南。
从ATCC获得的Nalm6细胞系经过筛选，确认无支原体污染。
这些细胞被稳定转导了GFP-荧光素酶慢病毒，以用于后续实验。
Nalm6细胞的培养在RPMI培养基中进行，补充了10% FBS和200 U ml−1青霉素-链霉素（Gibco, 15140122）。

In vivo xenograft mouse studies

体内异种移植小鼠研究

Para_01

总共1 × 10^6个Nalm6-荧光素酶细胞通过静脉注射到NSG小鼠体内，以建立白血病异种移植小鼠模型。
肿瘤注射后，小鼠被随机分组，然后开始治疗。
一周后，通过尾静脉注射，适应性输注了2 × 10^6个CAR T细胞。
使用Xenogen IVIS荧光/生物发光成像系统（PerkinElmer）每周监测肿瘤生长。
简而言之，小鼠被腹腔注射生物发光底物d-荧光素钾盐（150毫克/千克；Abcam, ab143655）。
注射后10分钟，小鼠被麻醉并置于发光成像系统中，以量化肿瘤负担。
存活的鼠在CAR T细胞输注后17天再次接受1 × 10^6个Nalm6-荧光素酶细胞的挑战。
当体重减轻超过基线体重的15%，或研究人员发现任何不适迹象，或根据每隔一天监测小鼠的兽医的建议，小鼠将被安乐死。

In vitro repeat stimulation assay

体外重复刺激测定

Para_01

CTL019细胞被解冻并在进行序贯染色前静置3-4小时，使用PE标记的单克隆抗FMC63 scFv抗体和抗PE微珠，按照先前建立的协议进行。
通过MACS柱磁力富集的CAR+细胞，然后在六孔板中与Nalm6细胞按指定的E/T比例共培养。
在整个检测期间，每天使用流式细胞术评估CAR T细胞和Nalm6细胞的数量。
必要时添加额外的Nalm6细胞以维持指定的E/T比例。
每个评估条件均准备了3或4个技术重复。

Enhanced type 2 CAR T cell manufacture

增强型2型CAR-T细胞制造

Para_01

增强型2型CAR T细胞的制造过程主要遵循先前建立的协议，有一个显著的变化是在整个培养和扩增过程中添加了10 ng ml−1或50 ng ml−1的IL-4（R&D Systems, 204-IL-010）。
这种补充是在传统制造程序中标准包含的5 ng ml−1的IL-7（Miltenyi Biotec, 130-095-367）和IL-15（Miltenyi Biotec, 130-095760）之外引入的。

Flow cytometry

流式细胞术

Para_01

从尾部在指定时间点收集小鼠血液（50 μl），用于外周CAR T细胞分析。
收集的样本在PBS与EDTA（2 mM）中重悬，使用ACK裂解缓冲液（Gibco, A1049201）去除红细胞。
为了表面标记染色，细胞在4 °C下与抗体面板孵育30分钟，随后进行活/死细胞染色。
细胞洗涤后，在含0.2% BSA的PBS中重悬，用于流式细胞术分析。
细胞内细胞因子染色首先通过在37 °C下用细胞刺激鸡尾酒（Invitrogen, 00-4970-03）刺激细胞5小时以诱导细胞因子产生。
随后，细胞按前述方法进行表面标记和活/死染料染色，然后使用Cytofix/Cytoperm Kit（BD Biosciences）固定和透化。
根据制造商的协议，使用指示的抗体面板进行细胞内染色。
使用Attune NxT流式细胞仪及Attune NxT软件v.3（Invitrogen）收集数据，并使用FlowJo v.10.6.1（Tree Star）进行分析。
门限边界由同型对照和荧光减一对照确定。

Para_02

以下抗体，每种都带有其指定的克隆，从BioLegend采购，并用于体外和体内功能分析中的流式细胞术分析：FAS（DX2，305624），IL-13（JES10-5A2，501916），CD27（LG.3A10，124249），CD45RO（UCHL1，304238），TNF（MAb11，502940），CD3（OKT3，317306），GZMB（GB11，515403），CD223（LAG-3）（11C3C65，369312），CD366（TIM3）（F38-2E2，345016），CD197（CCR7）（G043H7，353235），IL-4（MP4-25D2，500832），CD19（HIB19，302216），CD4（OKT4，317416），IL-5（TRFK5，504306），CD8（SK1，344724），CD279（PD-1）（EH12.2H7，329952），KLRG1（MAFA）（2F1/KLRG1，138426），IFNγ（4S.B3，502530）以及Zombie Aqua Fixable Viability Kit（423102）。
单克隆抗FMC63抗体（Y45，FM3-HPY53）从ACRO Biosystems购买。
细胞表面抗体在染色过程中按1:100稀释使用，细胞内抗体按1:50稀释，活/死染色按1:1,000稀释。

Single-cell transcriptome data processing and analysis

单细胞转录组数据处理与分析

Para_01

共对44对单细胞RNA测序（scRNA-seq）和CITE-seq文库进行了测序；详细的数据质量指标见补充表2。
测序数据通过与GRCh38人类参考基因组进行比对，随后进行条形码和独特分子标识符计数，最终使用Cell Ranger v.6.1.2（10x Genomics）生成数字基因表达矩阵。
后续的数据分析按照Seurat v.4流程进行。
哈希寡核苷酸表达用于将细胞解复用回其原始样本，同时识别并排除跨样本双细胞。
标记为双细胞（检测到两个条形码）或缺乏条形码的细胞被排除在分析之外。
仅保留基因计数在200到7,000之间且线粒体基因含量小于10%的细胞用于下游分析。
对于全数据集分析（图1b），采用随机分组方法，每4个文库合并并指定为单一批次，共生成11个不同批次。
随后，使用一种名为互惠主成分分析（PCA）的快速整合方法，并采用默认参数来减轻潜在的批次效应，并实现大规模数据整合。
这包括根据测序批次将数据集分割成Seurat对象，对每个数据集进行独立标准化和可变特征识别。
在数据集间的重复可变特征上进行整合和PCA，使用FindIntegrationAnchors函数识别锚点，并使用IntegrateData进行后续数据集整合。
然后实施了标准的工作流程进行可视化和聚类。
对于来自发现队列和验证队列的基线未刺激或CD19-3T3刺激的CAR T细胞的亚聚类分析，使用了Seurat中的sctransform标准化方法。
该方法专门设计用于捕捉scRNA-seq数据集中的更尖锐的生物异质性，这些分析中未观察到显著的批次效应。
使用FindMarkers函数通过细胞组或簇之间的成对比较来识别差异表达基因（DEGs），应用0.25的对数转换倍数变化阈值来选择显著基因。
此外，基于预定义基因集的模块评分使用AddModuleScore函数进行计算。

scATAC and gene co-profiling data processing and analysis

scATAC和基因共分析数据处理与分析

Para_01

使用 Cell Ranger ARC v.2.0.2 (10x Genomics) 对样本进行解复用、条形码处理、开放染色质区域的识别，以及从测序数据中对单细胞进行转录本和峰可及性的同时计数。
每个条形码的输出矩阵通过 Signac (v.1.12.0) 和 Seurat (v.4) 进行联合 RNA 和 ATAC 分析。
计算了每个细胞的质量控制指标，包括核小体带型（存储为 nucleosome_signal）和 ATAC 组分的转录起始位点（TSS）富集分数。
这些指标用于识别和移除异常值，每个样本的质量报告详细记录在补充表4中。
质量过滤标准遵循默认设置。
具体而言，保留的细胞需满足 ATAC 峰计数在 1,000 到 100,000 之间，基因计数在 1,000 到 25,000 之间，nucleosome_signal 低于 2 且 TSS 富集分数超过 1。
为提高峰识别的准确性，我们使用了 MACS2 v.2.2.9.1 的 CallPeaks 功能，这是一种在染色质可及性分析中广泛使用的峰调用工具。
随后，我们使用 Seurat v.4 中的加权最近邻方法构建了一个联合邻接图，代表基因表达和 DNA 可及性测量。
为研究感兴趣基因的潜在调控元件，我们使用了 LinkPeaks 功能。
该方法通过计算基因表达与附近峰的可及性之间的相关性来识别可能调控基因表达的峰集，同时校正 GC 含量、整体可及性和峰大小引起的偏差。
为准备基序分析，我们使用 AddMotifs 功能将 DNA 序列基序信息整合到数据集中。
此外，我们使用 chromVAR 计算了每个细胞的基序活性分数。
为进行具有位置信息的基序足迹分析，我们使用 Footprint 功能收集并在检测中存储所有必要数据。

L–R interaction analysis

L-R交互分析

Para_01

R工具包Connectome（v.1.0.0）用于研究细胞-细胞连接模式，使用我们单细胞RNA测序数据集中的配体和受体表达值，采用默认参数。
归一化的Seurat对象作为输入，聚类身份用于定义交互网络中的节点，结果生成一个通过特定L-R机制连接节点对的边列表。
我们选择了排名靠前的交互对进行可视化，优先考虑那些在生物学和统计学上更可能显著的对，基于每对的缩放权重。
边的厚度与相关权重成正比，较宽的边表示更高的交互水平。
sources.include和targets.include参数用于指定发出配体信号的源聚类和表达感受配体的受体基因的目标聚类。

Ingenuity pathway analysis

创新通路分析

Para_01

Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen)被用于识别由每个识别出的聚类或响应组特征性差异表达基因（DEGs）所调控的潜在信号通路。
为了实现这一目标，差异表达基因列表及其相应的倍数变化值、P值和调整后的P值被加载到数据集中。
使用Ingenuity知识库（仅基因）作为参考集，进行了核心表达分析。
从识别出的经典通路中特别选择了T细胞相关的信号通路，以代表每个组的主要功能剖面。
特定通路的激活或抑制水平通过z分数指标来确定。
从概念上讲，z分数作为一种统计度量，评估我们差异表达基因数据集中分子的实际表达模式与基于文献的特定注释的预期模式的一致程度（z > 0，激活/上调；z < 0，抑制/下调；z ≥ 2或z ≤ −2可视为显著）。
每个识别出的信号通路的显著性通过右尾Fisher精确检验来确定，P值反映了我们单细胞RNA测序数据集中的分子与经典通路参考数据集之间关联的概率。

Statistical analysis

统计分析

Para_01

统计分析使用Prism v.10（GraphPad）或R v.4.3.1进行。
除非另有说明，数据以均值±标准误表示。
对于涉及三个或更多组的比较，我们使用单因素方差分析及Tukey多重比较检验。
对于两组之间的比较，非参数数据使用双尾Mann–Whitney U检验，参数数据使用双尾Student’s t检验，配对非参数数据使用双尾Wilcoxon配对符号秩检验。
对于单细胞水平的比较，通常以小提琴图表示（如扩展数据图7b,j所示），比较中包含了每个BCA组中每个患者前10%单细胞的标准化表达值。