Kallisto — 基于伪比对的转录本定量

生信菜鸟团

发布于 2024-06-26 09:11:24

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发布于 2024-06-26 09:11:24

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工欲善其事必先利其器

Kallisto

Kallisto是由Nicolas Bray主导开发的一款专门用于从 RNA-Seq 数据中量化转录本的表达丰度的工具。发表于 2016 年的《Nature Biotechnology》期刊，其具有以下特性：

伪比对技术：Kallisto 使用一种称为“伪比对”的技术，可以在不需要完全比对读取到参考序列的情况下，迅速判断读取与目标转录本的兼容性。这一过程显著加快了数据处理的速度。
高效性能：在标准的 RNA-Seq 数据集上，Kallisto 能够在不到 3 分钟的时间内量化 3000 万条人类的 RNA-Seq reads。
准确性：虽然 Kallisto 使用伪比对而非完全比对，其准确性与现有的转录本量化工具相比仍具有竞争力。事实上，由于伪比对方法对读取中的错误具有较强的鲁棒性，在许多基准测试中，Kallisto 的表现优于其他工具。
适用性广泛：Kallisto 不仅适用于处理批量 RNA-Seq 数据，也可用于单细胞 RNA-Seq 数据分析。它可以与如 bustools 等其他工具结合使用，处理和分析单细胞数据。
易于使用：Kallisto 设计了简单直观的命令行界面，使得用户能轻松上手。

官网

官网：

https://pachterlab.github.io/kallisto/

Github：

https://github.com/pachterlab/kallisto

发表文章

题目：Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification 期刊：Nat Biotechnol 作者及单位: Nicolas L Bray && University of California, Berkeley, California 日期：2016/5 DOI：10.1038/nbt.3519

如何安装

conda

使用conda 安装，方便管理整个组学分析的软件

conda activate RNAseq
conda install kallisto

不过最近conda的镜像很多挂掉了，如果conda下载不下来的话，也只可以直接从GIthub下载安装，也非常方便

从GitHub安装

预编译的二进制版，下载解压即可使用

cd software/
wget -c https://github.com/pachterlab/kallisto/releases/download/v0.50.1/kallisto_linux-v0.50.1.tar.gz
tar -xf kallisto_linux-v0.50.1.tar.gz

解压即可使用

总的来说，安装起来还是非常方便的

功能简述

最小化使用

其实可以对比salmon来学习。见 Salmon — 兼具高效、精准及偏差感知的RNA-seq定量工具

Bulk转录组

构建索引

##下载转录本文件
wget -c https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/gencode.v45.transcripts.fa.gz
##文件大小
454M 1月  11 21:27 gencode.v45.transcripts.fa


mkdir homo_gencode_trans_kalliso
~/biosoft/kallisto/kallisto index -k 31 -t 8  -i homo_gencode_trans_kalliso.idx  gencode.v45.transcripts.fa

-i #指定构建索引的输出文件名
-t 8 #设置线程
-k #指定用于索引构建的 k-mer 长度。默认值为 31，这是 k-mer 长度的最大值。k-mer 长度影响索引的精确性和内存使用量
-T #指定临时目录，默认是tmp
--make-unique #如果在 FASTA 文件中存在重复的目标名称，此选项将自动替换这些名称以确保它们的唯一性。这有助于避免在量化过程中发生名称混淆

##输出文件大小
422M 6月  25 00:15 homo_gencode_trans_kalliso.idx

建索引

定量

###双端
~/biosoft/kallisto/kallisto quant \
-i ~/ref/homo/gencode/homo_gencode_trans_kalliso.idx \
-o ./paired_out2 -t 4 \
/home/data/t020559/RNAseq/GSE128101/b_rawdata/homo_pe/SRR8707539_1.fastq.gz \
/home/data/t020559/RNAseq/GSE128101/b_rawdata/homo_pe/SRR8707539_2.fastq.gz 

-i #索引文件
-o #输出目录
-t #设定线程
--plaintext #仅输出文本格式。默认是HDF5格式

--single #指定输入的是单端测试数据
-l #指定估计的平均片段长度
-s #指定片段长度的标准偏差
-l 和 -s 这些参数对于单端数据是必需的，因为无法从单端数据中直接估计它们


###单端-小鼠测序数据
~/biosoft/kallisto/kallisto quant \
-i ~/ref/mouse/gencode/mouse_gencode_trans_kalliso.idx \
-o ./single_out -t 4 --single -l 100 -s 30 \
~/RNAseq/GSE128101/b_rawdata/SRR8734842.fastq.gz

双端日志

单端日志

结果文件

默认输出3个结果

abundance.h5：HDF5格式的定量结果文件
abundance.tsv ：文本格式的定量结果文件。
run_info.json ：Kallisto执行信息，可以忽略

abundance.tsv

单细胞数据

目前支持的技术列表

$~/biosoft/kallisto/kallisto bus -l
List of supported single-cell technologies

short name       description
----------       -----------
10xv1            10x version 1 chemistry
10xv2            10x version 2 chemistry
10xv3            10x version 3 chemistry
Bulk             Bulk RNA-seq
SmartSeq2        Smart-seq2 (multiplexed)
BDWTA            BD Rhapsody WTA
CELSeq           CEL-Seq
CELSeq2          CEL-Seq version 2
DropSeq          DropSeq
inDropsv1        inDrops version 1 chemistry
inDropsv2        inDrops version 2 chemistry
inDropsv3        inDrops version 3 chemistry
SCRBSeq          SCRB-Seq
SmartSeq3        Smart-seq3
SPLiT-seq        SPLiT-seq
STORM-seq        STORM-seq
SureCell         SureCell for ddSEQ
VASA-seq         VASA-seq
Visium           10x Visium Spatial Transcriptomics

实例测试

~/biosoft/kallisto/kallisto bus \
-i ~/ref/homo/gencode/homo_gencode_trans_kalliso.idx \
-o ./scRNA_out4 -t 4 -x 10xv3 \
~/scRNA/PRJNA971592/b_rawdata/split/SRR24516561.lite_2.fastq.gz \
~/scRNA/PRJNA971592/b_rawdata/split/SRR24516561.lite_3.fastq.gz

-x #指定单细胞测序技术

结果文件

默认输出结果

 12M 6月  25 18:47 matrix.ec
4.8G 6月  25 18:47 output.bus
 592 6月  25 18:47 run_info.json
 18M 6月  25 18:47 transcripts.txt

matrix.ec ：这个文件包含了等价类的信息。每个等价类由一个唯一的编号和与之对应的一组转录本编号组成。通常包含两列，第一列是等价类的编号，第二列是该等价类包含的转录本的索引

matrix.ec

output.bus：这是一个 Barcode, UMI, Set (BUS) 格式的文件。包含了有关每个读取的信息，如细胞的条形码（barcode）、UMI和读取所属的转录本等价类。BUS 文件是一个二进制文件，可以被用于后续的数据处理和分析步骤，如使用 bustools 这样的工具进一步处理。

run_info.json ：Kallisto 执行的信息，可以忽略

transcripts.txt ：单列，每行是一个转录本的名称。这个文件列出了分析中使用的所有转录本的名称，这些转录本名称通常与分析所使用的参考转录组索引文件一致。它主要用于将转录本的索引编号映射到具体的转录本名称。