用于蛋白质结构分析的圆二色光谱

在蛋白质研究领域，了解蛋白质的三维结构对于揭示其功能至关重要。圆二色光谱法（CD光谱法）作为一种强大的分析技术，为我们提供了一种在不进行高分辨率结构测定的情况下，快速获取蛋白质结构信息的方法。

本文将详细介绍CD光谱法的原理、仪器工作原理及其在蛋白质结构分析中的应用。

01 CD光谱法的定义

圆二色光谱法（CD光谱法）的命名源自最早观察到此现象的矿物——'cordierite'。CD光谱法是一种用于研究分子结构，特别是蛋白质和核酸等生物大分子的二级和三级结构的分析技术。

02 CD光谱法的原理

CD光谱法的原理基于手性分子对左1.6旋和右旋圆偏振光的选择性吸收。以下是CD光谱法的详细原理

2.1 光的偏振性

光作为电磁辐射的一个主要形式，包含两个互相垂直的矢量：电场矢量（E）和磁场矢量（M）。自然光通常不是偏振的。为了更直观地理解线性偏振光与圆偏振光的差异，让我们通过一段动图来一探究竟。

由图可以看出，线性偏振光的特性是电场振动方向固定不变，而振幅则随之变化。而圆偏振光则以一种特定的方式，围绕一个假想的轴旋转。这种旋转的产生，是由于光的电场和磁场之间存在四分之一波长的相位差。这种相位差导致光波前发生扭曲，从而形成了圆偏振光。

正是这种光的特性，构成了CD光谱法分析蛋白质结构的科学基础。

2.2 手性分子的特性

旋光性是手性分子特有的现象，这些分子的碳原子连接着四个不同的基团。线性偏振光实际上是左旋和右旋圆偏振光的叠加。

当线性偏振光通过手性分子时，分子的非对称性使得光的传播方向发生偏转，这个偏转角度称为比旋度。比旋度揭示了分子对左旋或右旋光的偏转效果。

这种偏转导致原本的圆偏振光在通过手性分子后，转变为椭圆偏振光。通过观察这种光的旋转效应，我们可以使用CD光谱法来研究分子的手性特征，从而在不进行高分辨率结构测定的情况下，快速获取蛋白质结构信息。

2.3 生色团

生色团的CD信号是由它们的电子跃迁产生的，这些跃迁受到分子手性的影响。CD光谱法通过测量这些生色团在不同波长下对左旋和右旋圆偏振光吸收的差异，为我们提供了分子结构的详细信息。详细内容点此查看

2.4 CD光谱的生成

为了说明圆二色光谱的工作原理，我们将以物质A为例进行详细探讨。想象两束入射光：左侧的椭圆E偏振光和右侧的椭圆E偏振光。

在它们进入物质A之前，振幅和能量都是相同的，形状和大小也相同。然而，当这些光束穿过物质A时，它们会与物质中的分子相互作用。在这个过程中，与左侧的偏振光相比，右侧的偏振光被吸收得更多。这种吸收上的不平衡导致了一种新的光状态——椭圆偏振光的形成。

这种吸收的差异，我们称之为ΔA，它是通过计算左侧偏振光的吸收与右侧偏振光吸收的差值得出的。ΔA的测量是CD光谱法的核心，它通常以椭圆率来表示，单位是厘米2/克或者厘米2/十分之一。椭圆率的数值反映了分子对手性光的选择性吸收，为我们提供了物质A结构特性的重要线索。

值得注意的是，这些吸收差异通常极其微小，大约在10毫度范围内。因此，我们必须确保能够准确观察到这些细微的变化。鉴于圆二色光谱仪对噪音的高度敏感性，实验中采用干净的比色皿和低吸收性的缓冲液至关重要。为了最小化噪音干扰，缓冲液中常采用极低浓度的盐，以优化信噪比。

03 圆二色光谱仪工作原理

现代圆二色光谱仪，进一步提升了CD光谱法的应用精度和范围。这些仪器利用氙灯或氦氩灯发出非偏振光，通过单色仪将其转换为线性偏振光，再利用光电调制器（PEM）产生右旋和左旋圆偏振光照射样品。

样品与光的相互作用产生的信号差异被高度敏感的光电倍增管检测并放大，转化为数字读数，使研究人员能够精确测量蛋白质的吸光差异。

04 CD光谱法的应用

CD光谱法的原理基于手性分子对左旋和右旋圆偏振光的选择性吸收。以下是CD光谱法的详细原理

4.1 揭示蛋白质的二级结构

CD光谱法能够帮助我们识别蛋白质中的α螺旋、β折叠和无规卷曲等结构。通过将目标蛋白质的CD光谱与标准光谱进行比较，我们能在进行轴向衍射或核磁共振（NMR）等深入分析之前，获得对其结构的初步了解。

观察下图，波长范围从190nm到15nm，覆盖了远紫外光谱区域。在这个范围内，蛋白质的二级结构会展现出独特的吸收光谱特征，这些都可以通过椭圆率（用θ表示）来观察。

α-螺旋的光谱由黑线表示，反平行β-折叠由红线表示，无序的随机卷曲则由绿线表示。而蓝色和浅蓝色线分别代表胶原三螺旋和D-型胶原。利用这些视觉特征，我们可以将目标蛋白质的光谱与己知的二级结构光谱进行比对，并借助数学函数评估它们之间的拟合程度。

通过此类比较，我们能够估算蛋白质中各种二级结构的比例，例如，判断一个蛋白质是否主要由80%的α-螺旋和20%的B-折叠构成，或是否包含70%的a-螺旋、20%的B-折叠以及10%的无序卷曲。这种估计为我们提供了对蛋白质三维结构的初步但准确的理解，并且可以相对容易地完成。

4.2 洞察蛋白质三级结构

更进一步，CD光谱法还能提供对蛋白质三级结构的洞察。通过分析远紫外（190至260nm）和近紫外（260至320nm）的光谱，我们能够获得蛋白质整体构型的详细信息。

例如，通过比较野生型与突变型蛋白质的光谱，我们可以评估它们在结构上的相似性或差异。进而推断突变型蛋白质活性的丧失是否与三级结构的微小变化有关。

4.3 评估辅因子结合位点

CD光谱法还可以用来评估辅因子结合位点的完整性和蛋白质结构的稳定性。例如，焦磷酸吡哆醛和血红素等辅因子与蛋白质结合时吸光度的显著增加，这一变化可以通过CD光谱法来监测，为我们提供蛋白质功能和稳定性的重要信息。

以两种不同形式的蛋白质为例：一种是原核蛋白，另一种是重组蛋白，后者可能由两个不同的部分连接而成。通过CD光谱法，我们可以比较这两种蛋白质的结构和功能，即使它们在序列上有所不同。我们通过重组技术重新构建蛋白质，首先分别表达并纯化蛋白质的各个片段，然后将其组合，形成完整的蛋白质。

通过圆二色光谱分析，我们能够观察到蛋白质在不同波长下的特性变化。尽管在远紫外区域，野生型与突变型蛋白质的光谱差异不大，但在更长波长下，两者之间出现了显著的光谱偏移，这通常是由于辅因子结合的差异所致。

突变型蛋白质展现出与野生型不同的吸收特征，为我们提供了关于辅因子结合位点可能的干扰以及蛋白质结构稳定性受影响的线索。

4.4 监测蛋白质构象细微变化

此外，圆二色光谱技术还具备监测蛋白质构象细微变化的能力。通过逐步升高温度并观察蛋白质的光谱变化，我们可以了解蛋白质结构稳定性的降低过程。在近紫外光谱区域，信号强度的减弱为揭示蛋白质特定构象变化的关键区域提供了重要线索。

4.5 研究蛋白质折叠

在蛋白质折叠研究领域，圆二色光谱技术同样发挥着重要作用。通过研究不同形式的蛋白质折叠过程，我们能够揭示蛋白质折叠的动态机制，包括折叠速率和折叠常数。

这些研究为蛋白质在折叠前可能经历的"熔球态"假说提供了支持，然而，值得注意的是，对于小型肽而言，该状态尚未通过圆二色光谱技术直接观测到，这可能表明小型肽的折叠过程与大型蛋白质存在显著差异。