Avi-Tag+BLI 珠联璧合：重组表达生物素化蛋白用于生物分子互作实验

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背景介绍

BLI（Biolayer Interferometry）生物膜干涉技术是一种高灵敏度的实时分析技术，常用于研究分子间相互作用、亲和力、结合动力学等。其基本原理是，当光线照射到薄膜表面时，反射光会产生干涉现象，干涉图样的变化与表面膜的折射率变化相关。不同分子与表面膜之间的结合会导致折射率变化，从而引起干涉信号的变化。这些信号可以用来定量分析分子相互作用的动力学和亲和力。

图1 BLI 技术原理示意图

在进行 BLI 验证相互蛋白与蛋白或者蛋白与小分子的相互作用时，通常是将蛋白通过氨基偶联的方法将蛋白与生物素进行共价连接，通过生物素和链霉亲和素的强亲和力固定在 BLI 探头上，随后进行相互作用的检测。

然而通过化学方法进行偶联存在许多问题，如蛋白损失大、浓度被稀释，随机氨基偶联，蛋白失活，蛋白固化高度达不到4nm以上等等。下面给大家介绍一种定点生物素化的蛋白标签-Avi Tag。

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Avi Tag简介

Avi Tag 是由15个氨基酸残基构成的短肽标签（GLNDIFEAQKIEWHE），拥有一个可生物素化的赖氨酸残基，在生物素连接酶（例如BirA）作用下，该赖氨酸能够特异性的共价连接上一个生物素分子。将目的蛋白与 Avi Tag 融合之后表达，可以特异性的给目的蛋白在体内外进行生物化修饰，同时 Avi Tag 只有15个氨基酸残基，可以尽量降低标签对目的蛋白的活性影响。

图2 BirA 催化 Avi Tag 共价连接生物素示意图

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Avi Tag融合蛋白表达纯化基本流程

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合成目的蛋白的基因序列，插入到 Avi Tag 载体上（如 pET-His-MCS-Avi 或 pET-Dual-His-MCS-Avi-BirA），构建筛选重组质粒。

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将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株（如DE3），挑取单菌落培养至对数生长期，加入相应浓度的诱导剂（如IPTG）进行诱导表达；如果使用的是双表达载体，则在诱导表达时同时加入生物素，在诱导目的蛋白表达的同时进行生物素化修饰。

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通过亲和标签（如6×His标签）纯化目的蛋白，并加入相应的 BirA 和生物素，对目的蛋白进行生物素化修饰。如果是使用双表达载体进行载体构建，在诱导表达阶段即可完成生物素化修饰。

图3 Avi Tag 融合蛋白表达纯化流程

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Avi Tag融合蛋白的优势

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可以对融合蛋白的特异位点进行生物素化，特异性高。

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如果在诱导表达时同步进行生物素化，目的融合蛋白初步亲和纯化后可直接用于 BLI 实验。

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当与链霉亲和素包被的表面结合时，由于对生物素化的精确控制，使得 Avi 标签的蛋白方向一致性高，提高结合分析实验的效率。

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生物素化蛋白用于BLI检测的基本流程

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将 SA 传感器用 PBS 进行平衡，然后加入生物素化的蛋白，使蛋白通过生物素-链霉亲和素的相互作用进行固定，然后用生物素封闭，并在 PBS 缓冲液中洗涤，洗去未结合的生物素。

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将待检测的小分子或者蛋白溶液梯度稀释，并与传感器孵育，收集数据。

图4 典型的 BLI 相互作用分析流程

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案例分享

通过BLI验证携带Avi Tag的新冠病毒RBD区域与scFv（ single‐chain variable fragment ）的相互作用[1]

上海中科院团队首先通过 ELISA 实验筛选与新冠病毒存在相互作用的 scFv，之后通过融合表达携带 Avi Tag 的新冠病毒 RBD 区域，通过将 RBD 蛋白生物素化，使用 BLI 实验验证了 RBD 与 scFv 的相互作用。

图5 BLI 验证 RBD-Avi tag 与 scFv 的相互作用

参考文献

佰莱博生物提供生物物理、生物化学、细胞生物学及计算机模拟等多个层面分子互作筛选及验证服务。主要技术平台包括：SPR、MST、ITC、BLI、DSF、Small Pull-Down、小分子免疫荧光（小分子荧光共定位）、Target engagement (TE) assay、CETSA、GST Pull-Down、Co-IP 等分子互作验证技术；配体垂钓、化学蛋白质组学（ABPP）、CETSA-MS、DARTS-MS、体外药筛 (AlphaScreen、ADP-Glo、TR-FRET) 等分子互作筛选技术；化合物合成及探针制备、生物偶联、蛋白表达纯化等生物活性分子制备技术；高内涵细胞成像与分析(HCS，High-content screening)、Incucyte长时间活细胞成像分析、酶联免疫斑点技术 (ELISPOT)、Luminex液相悬浮芯片等细胞分析技术；nanoDSF、MALS (动静态光散射)、AUC (分析型超离)、CD (圆二色光谱技术) 等生物分子表征技术；计算机模拟 (分子对接、虚拟筛选、反向找靶、分子动力学模拟) 等生物信息学技术。提供生物分子互作分析、靶点筛选、药物筛选、化合物合成及生物偶联、蛋白表达纯化、细胞因子检测、生物大分子表征及制剂筛选等实验服务。

目前，佰博莱生物分子互作平台已经完成了1500多种蛋白的分子互作检测实验。针对热门医药研究靶点如：T 细胞的主要免疫调节因子 (Gal-1，Gal-3和Gal-9)、与糖尿病相关的胰岛素受体 (IR-A、IR-B、IGF-1R)、GLP-1R 等、血管内皮生长因子 (VEGF 121、VEGF165)、免疫球蛋白 Fc 受体 (Fcγ RI、Fcγ RIIB、Fcγ RIIIA、不同种属的FcRn) 、免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子 (Nectin-1，Nectin-2，Nectin-3，Nectin-4) 及整合素家族 (aVβ5、ITGB1、aVβ3等) 等重要靶点已具备成熟检测方法。

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