佰莱博干货分享：CELL综述蛋白质与蛋白质（PPI）相互作用

前言

单个蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的鉴定始于二十世纪八十年代，最初采用蛋白质亲和层析和抗体免疫共沉淀技术。随着新技术的不断涌现，PPI 的分析已经扩展至全基因组范围，逐步引入了细胞内标记方法、亲和纯化（AP），以及质谱（MS）和共分馏质谱（CF-MS）等先进技术。目前，交联质谱（XL-MS）和冷冻电镜（cryo-EM）等技术，有效区分了相同或不同蛋白质复合物之间的直接和间接相互作用。这些强有力的方法，以及如 AlphaFold 等人工智能应用的前景，预示着未来对 PPI 及蛋白质复合物的深入理解，包括能量驱动的蛋白质机器，将为基础生物学和疾病研究带来全新的见解。

2024年11月14日，多伦多大学的 Jack F. Greenblatt 和加州大学旧金山分校的 Nevan J. Krogan 共同在 Cell 在线发表了题为“ Discovery and Significance of Protein-Protein Interactions in Health and Disease ”的综述论文，该文章系统的回顾了蛋白相互作用的研究历程、技术发展历程及在生命健康中的意义，并分析了新兴技术对该领域发展的推动，为未来的治疗策略提供新的视角。

论文概要

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蛋白亲和层析法鉴定蛋白质相互作用探究生物功能

蛋白质与其他分子的相互作用通常具有高度的特异性，在研究早期，通常利用蛋白质亲和层析来鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions, PPIs）。最开始，采用亲和层析法纯化与特定分子结合的蛋白质或表征酶和其他蛋白质与底物、辅因子和其他相互作用物质的方法。最早在1910年，Starkenstein 利用不溶性淀粉作为配体纯化α-淀粉酶。后续该方法不断改进，将酶和蛋白抗原耦合到琼脂糖上，用于纯化酶和抗体。

虽然这种固定的纯化蛋白可被用于在细胞提取物中搜索该蛋白的其他相互作用伙伴，但最早于20世纪80年代才首次利用蛋白质亲和层析技术搜索与噬菌体的λ和噬菌体T4蛋白相互作用的蛋白质（图1）。对于噬菌体λ，使用λ的N蛋白作为配体进行亲和层析，鉴定到 NusA 蛋白与λ的N蛋白互作。对于T4蛋白，采用 T4 gene 32 单链 DNA 结合蛋白固定在树脂上，鉴定到至少10种T4蛋白和三种大肠杆菌宿主蛋白特异结合，其中9种T4蛋白被确定参与T4的复制和重组。

蛋白质亲和层析的一个重要优势是可以增加固定配体的浓度，以便检测小于105M-1的相当弱的蛋白相互作用。

图1 PPI 进展与技术创新

1.1 蛋白亲和层析的局限性

早期，蛋白质亲和层析需要克服2个障碍，第一是需要高度纯化的蛋白质作为配体，但在1980年代亲和层析标签尚未引入使用，用于蛋白质过表达的载体尚未普遍使用。第二个主要障碍是识别相互作用的蛋白，如果被研究的生物系统的蛋白质组分已经被纯化，并且它们在 SDS-PAGE 上的迁移率是已知的，但在缺乏全面的遗传调查的情况下，即是在大肠杆菌和果蝇中，鉴定相互作用蛋白质的功能必须依靠猜测其功能并进行适当的生化测定。

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使用抗体和融合蛋白鉴定PPI

一种替代蛋白亲和层析的方法是针对纯化蛋白制备抗体，然后使用这些抗体与其相互作用的蛋白一起从细胞提取物中免疫沉淀该蛋白。在这种类型的一项重要早期实验中，一个具有未知功能的宿主蛋白，在 SDS-PAGE 上表观分子量为53 kDa，一个仍然简称为 p53 的肿瘤抑制蛋白，与 SV40 大T抗原共免疫沉淀，而肿瘤抑制蛋白 RB 与其他病毒致癌蛋白共免疫沉淀。另一个重要的成功案例是使用针对果蝇 TATA 盒结合蛋白（TBP）的单克隆抗体，免疫共沉淀 RNA 聚合酶II通用起始因子 TFIID 的其他亚基，称为 TBP 结合因子（TAFs），从而导致它们在各种物种中的鉴定、分子克隆和功能特征化，作为转录共激活因子。

随着更多蛋白在20世纪80年代被克隆，一个重要的进步是融合蛋白的设计，这些融合配体或标签可以容易地通过亲和层析在单个步骤中纯化肽或蛋白质。1988年描述的融合伴侣是 GST（谷胱甘肽-S-转移酶）和 MBP（麦芽糖结合蛋白），后续结合 IgG 的 Protein A，结合Ni的多组His，HA等标签陆续被用于亲和层析。在数千个这样的实验中，结合到琼脂糖珠的融合蛋白与细胞提取物混合，Pull down 相互作用的蛋白。

2.1 免疫共沉淀和Pull down的局限性

与蛋白亲和层析相比，免疫共沉淀不适用于多蛋白研究，因为它不仅需要将目标蛋白纯化出来，还需要准备高度特异的抗体。还有可能这种抗体会干扰目标蛋白的组装成蛋白复合物。此外，无论用于 Pull down 的标签是什么，如果融合伴侣阻止目标蛋白与其一个或多个伙伴的相互作用，或者阻止其组装成蛋白复合物，这种方法可能失败。

此外，在基因组测序普及前，克隆 cDNA 缓慢而费力。并且过表达融合蛋白在大肠杆菌中通常不可溶，即使它是原核蛋白，尤其当它是一个缺乏翻译后修饰（PTMs）或分子伴侣或两者都缺少的真核蛋白。为了克服其中一些问题，最终开发了在昆虫、酵母和哺乳动物细胞以及其他系统中过表达蛋白的系统。无论是使用蛋白亲和层析、共免疫沉淀还是标签，要识别相互作用的蛋白，以便可能对其功能和生物学相关性进行表征，在基因组测序和质谱法（MS）出现前鉴定蛋白仍然很困难的。

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引入MS以鉴定相互作用蛋白

1993年，用氨基酸特异性蛋白酶，如胰蛋白酶消化蛋白后获得的肽的质量可以通过 MS（质谱）鉴定，然后用于搜索 DNA 或氨基酸序列数据库以鉴定蛋白。液相色谱-串联质谱法的发展是一项重要的进步，它提供了复杂混合物中单个肽的更多识别信息，从而极大地促进了来自大基因组的蛋白质的识别（LC-MS/MS），其中肽通过 LC 分离，然后在质谱仪中通过碰撞诱导解离（CID）片段化，以及促进序列数据库自动搜索的算法。

3.1 细胞内蛋白标记后的AP

在制备细胞提取物之前，在其天然宿主细胞中表达标记蛋白质，然后纯化标记蛋白质及其相互作用蛋白质（亲和纯化，AP），再通过 MS 鉴定，具有重要的优点。第一，使用天然宿主通常避免了当蛋白质在异源系统中过表达时经常发生的蛋白质不溶性的常见问题。第二，标记的蛋白质将获得其天然的 PTM，这些可能有助于蛋白质溶解度和/或某些相互作用蛋白质的缔合。第三，蛋白质将在其天然伴侣和辅助伴侣存在下合成，这可能是它正确折叠所必需的。最后，如果将编码标签的 DNA 整合到通常编码蛋白质的基因中，以标记蛋白质的N或C末端，则标记的蛋白质将以其正常水平表达，从而避免由蛋白质过表达引起的人为相互作用。结合 MS 的蛋白质鉴定，该程序被称为亲和纯化（AP）和质谱（MS）（AP-MS）（图2A）。

图2 PPI 检测方法

3.2 AP-MS的局限性

AP-MS 用于鉴定 PPI 的一个重要限制是 PPI 可能是由于标签蛋白的过表达导致，而不是蛋白本身之间的互作。另一方面，一些蛋白间的相互作用可能非常弱，在 AP 中涉及的洗涤步骤期间解离。使用全细胞提取物的所有方法（包括蛋白质亲和层析、Pull down、免疫沉淀和AP-MS）的共同问题是，一些蛋白可能在全细胞提取物中有相互作用，但由于它们不同的亚细胞定位和不同表达时间，它们在体内不可能相互作用。在缺乏预先存在的基因数据情况下，只能通过低通量的化学和遗传学方法用于破译由于蛋白质过表达或细胞提取物发现的PPI是否具有生物学意义。

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蛋白质共分离后质谱鉴定蛋白质复合物

如果多肽在一系列纯化步骤中被共沉淀，则它们被认为可能是蛋白质复合物的组分。该原理用于开发 CF-MS（共分馏-MS），其中用胰蛋白酶消化所得馏分中存在的蛋白，然后通过串联 MS 进行鉴定和定量（图2B）。例如，一项研究感染细菌的巨噬细胞观察到大量与巨噬细胞捕食相关的噬菌体-噬菌体和噬菌体-细菌的 PPI。CF-MS 特别适用于研究被病原体感染的细胞，因为它避免了标记和纯化宿主和病原体的蛋白质后进行 MS 分析。

4.1 CF-MS的优点和局限性

由于2种蛋白的共纯化可能是偶然的，AP-MS 鉴定的 PPI 可能是由蛋白质过表达人为驱动的，因此 AP-MS 和 CF-MS 是高度互补，通过 CF-MS 验证通过 AP-MS 鉴定的 PPI 很重要。CF-MS 的一个重要限制是 MS 无法检测细胞或组织中存在的所有蛋白质，此外，在所有的 CF-MS 研究中，有时在各种色谱图中的多个峰中发现单一蛋白质，这可能反映了它存在于多个蛋白复合物中。

与 AP-MS 不同，CF-MS 方法的优点是不使用可能破坏蛋白复合物的标签也不使用可能破坏蛋白复合物的抗体，还具有如下优点：混合提取物用于色谱和 MS 之前，可通过使用质量标签来区别标记不同细胞群体中的蛋白质，从而定量比较不同的细胞类型。CF-MS 的通量可使用6-plex或者18-plex串联质谱标记，从而实现对多个样本的多重分析，同时使得多个样本可以进行定量比较，并减少仪器时间。

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PPI验证和直接与间接相互作用的区分

5.1 PPI验证

现今有多种方法用来直接验证特定的 PPI，最常用是 IP-Westerns，其中在使用针对诱饵蛋白或标签的固定化抗体 pull down 诱饵蛋白后，通过免疫印迹法检测相互作用的蛋白。但这种方法不能排除 PPI 是间接或人为（互作仅发生在体外）的可能性。

为确定 PPI 是否发生在体内，现在有通过与诱饵蛋白的融合的荧光（FRET，荧光共振能量转移）和在固定细胞中进行邻位连接测定（PLA，邻位连接技术）进行检测等。但这些方法都不能区分 PPI 是直接还是由同一蛋白质复合物的另一组分介导。

5.2 区分直接和间接相互作用

考虑到增强或干扰疾病相关突变影响的 PPI 发挥药物的可能性，了解 AP-MS 或 CF-MS 鉴定的 PPI 是直接还是由中间蛋白质甚至核酸介导的非常重要。最直接的方法是通过体外重组并在体外测试相互作用，除生物化学方法外，还包括遗传学的酵母双杂系统。为在治疗上利用 PPI，可视化相互作用也非常关键，现在可以使用交联 MS（XL-MS）鉴定由 AP 分离的大蛋白质复合物中互作的肽链，该方法通常作为 Cryo-EM 进行结构测定的辅助验证方法。XL-MS 帮助研究者确定介导两种蛋白质之间接触的表面，这对于开发破坏蛋白的互作界面的药物非常重要。

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野生型和突变型人类和病毒蛋白相关的AP-MS技术

人们想知道蛋白相互作用如何在细胞的不同部分发生变化以及当条件变化时，相互作用如何随时间变化。例如，使用与神经退行性疾病相关的蛋白质突变体生成 PPI 网络，比较突变体和其相应的野生型蛋白时，许多蛋白质显示出差异结合。致癌突变的差异 AP-MS 实验中，例如，两种最普遍的头颈癌突变在 PIK3CA 的螺旋结构与（E542K和E545K）中，该突变导致了该酶对上游酪氨酸激酶 HER3 的亲和力增加。PIK3CA 和 HER3 之间更紧密的物理联系似乎对 HER3 抑制的增强相关，这表明 PPI 图谱的数据具有临床意义。实际上，进行基因发现分析时，不是在个体基因水平上进行，而是使用蛋白质复合物和功能途径，从中可以检测到生物学上的融合（图3A）。

最后，差异化的 AP-MS 实验也可以用来评估与病毒变种相关的突变的影响。例如，对主要 SARS-CoV-2 变种中观察到的个别突变的系统研究揭示了病毒如何不断进化以克服细胞防御机制，以及治疗方法，从而有效地在感染期间劫持宿主。

图3 PPI 图谱解释疾病遗传学并提供有治疗价值的见解

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蛋白质机器和复合物的生化解析与功能理解

7.1 蛋白质复合物功能的研究

获得蛋白质复合物并解析这些复合物的功能是研究蛋白的第一步，当数据不足时，优先研究那些被怀疑为“蛋白质机器”的复合物，蛋白质机器通常由多种基因产物组成，功能依赖这些产物的构象变化，其动力源通常是高能键的水解（ATP 或 GTP），保守的核苷酸结合位点可帮助识别这些复合物，而复合物的构象改变为其机器特性提供依据。

7.2 研究蛋白质机器的方法

解析蛋白质机器功能的标准方法通常依赖于纯化组分的重建。通过结合蛋白标签技术，这一过程得以简化，从而使得研究不同组分的反应能够通过动力学和化学分析进行。蛋白质机器的多构象转换特点，使其成为冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的重要研究对象。以往，研究人员需经历极其繁琐的实验，才能分析复合物在不同状态之间的转变。而如今，通过亲和纯化技术，研究者能够直接将感兴趣的复合物捕获到冷冻电镜的样品栅格上，大幅简化了实验流程。此外，最新的 cryo-EM 技术能够从混合物中识别复合物的“构象景观”，并结合 ATP 及模拟不同核苷酸结合状态的配体，从而进一步深化对新型蛋白质机器的理解。经典的蛋白质亲和层析方法也可用于筛选在结构分析中可能表现出弱结合能力的“辅助蛋白”。

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AI和Cryo-EM结合AP-MS和CF-MS影响PPI导向疗法的发展

AP-MS 研究中得到数据的一个主要限制是很难确定哪些蛋白相互作用反映了直接相互作用，哪些是通过间接的其他蛋白或核酸介导（图2）。通过 XL-MS 和冷冻电镜能解决，但这些方法费力（冷冻电镜），缺乏全面性（XL-MS）。基于人工智能方法进行蛋白结构预测的最新进展，Alphafold 已经在预测蛋白结构方面变得越来越精确。这些方法被扩展以预测蛋白质相互作用，并取得越来越成功的成果。Alphafold 已被用于帮助预测与自闭症相关的蛋白质相互作用质谱（AP-MS）中哪些是直接的，从而有助于识别与疾病状态相关的新蛋白质。此外，通过识别位于Alphafold 预测的直接蛋白质相互作用界面上的疾病突变，将有助于考虑优先使用靶向遗传研究和基于结构的努力，利用冷冻电镜（图3B）对这些相互作用和突变进行更详细的研究。

综合人工智能的方法不仅有助于为治疗遗传疾病的药物开发确定新的靶点，还能深入解析如何有效地“靶向”这些靶点。当突变干扰蛋白质间的相互作用时，利用分子胶恢复这些相互作用可能对机体有益（图3C）。基于人工智能的方法能够准确预测哪些化合物会与 PPI 界面特异性相互作用，这可能在药物开发中具有重要价值。实验方法与 AI 方法相结合，可以帮助改进 XL-MS 衍生的数据集，理论上可以提供 PPI 景观的全面视图（图4）。

图4 使用 CF、XL-MS 和 AI 方法生成全球高分辨率 PPI 地图的愿景

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结论

尽管基因组测序提供了有限的见解，但通过整合实验和计算方法，近年来在识别和表征蛋白质相互作用（PPI）方面取得了显著进展，为理解分子生物学和开发新疗法开辟了新途径。

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