**摘要：** 免疫组化切片刚完成AEC显色时红色清晰，经过乙醇脱水、二甲苯透明和树脂封片后却明显变浅，这类现象需要从显色产物的溶剂兼容性入手排查。AEC形成的玫瑰红色沉淀可溶于醇等有机溶剂，常规脱水封片流程可能导致信号丢失。本文围绕AEC染色褪色、苏木素复染和水性封片等问题，说明不同阶段颜色变浅的原因及相应处理思路。

**关键词：AEC显色、AEC染色褪色、免疫组化、乙醇脱水、水性封片剂、苏木素复染、DAB双染、多重免疫组化**

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## 一、AEC显色正常，封片后红色为什么消失？

AEC（3-amino-9-ethylcarbazole，3-氨基-9-乙基咔唑）是辣根过氧化物酶（HRP）显色体系中使用的显色剂，可形成玫瑰红色沉淀。与合适的苏木素复染配合时，红色信号与蓝色细胞核形成对比，便于观察组织中的染色分布。

在实际操作中，有时会遇到这样的情况：显色结束时红色清楚，后续按照熟悉的流程完成梯度乙醇脱水、二甲苯透明和树脂封片，再次观察时，红色已经变浅，部分区域甚至难以辨认。如果颜色变化发生在这些步骤之后，应优先回溯复染、脱水和封片环节，再判断是否需要调整抗体浓度或显色时间。

![组织切片染色操作场景](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/0601c4ed813cb8487cc9e3fe6c44128f.jpg)

**图1：组织切片染色操作场景。**

AEC反应形成的红色沉淀可溶于醇和部分其他有机溶剂。因此，乙醇脱水会使已经形成的显色产物溶失，后续二甲苯处理也不利于保留信号。用于常规AEC染色的操作资料通常要求避免显色后的酒精处理，并使用兼容的水性封片剂[2,3]。

## 二、脱水时变浅与保存后变浅，排查重点不同

“AEC褪色”常被用来描述不同阶段出现的颜色减弱，但处理方式需要与发生过程对应。若切片进入乙醇后红色迅速减弱，首先考虑显色产物被溶剂溶解；若封片时颜色正常，放置后逐渐变浅，则需要关注光照及保存条件。AEC显色产物对光氧化较敏感，避光有助于减少这一影响[3]。

这也解释了为什么单纯延长显色时间未必能解决封片后红色消失的问题。只要后续仍有不兼容的溶剂处理，已经形成的信号仍可能流失。反过来，避开乙醇脱水之后，也应继续关注切片的避光保存与封片状态。

判断时可以先明确颜色开始变化的节点：显色后、复染后、封片后，还是保存一段时间之后。将观察结果与对应步骤联系起来，比同时更改多个染色条件更有助于缩小排查范围。

## 三、AEC复染用什么苏木素？先确认配方和分化步骤

除了脱水环节，复染剂也可能使AEC接触到醇。部分Harris苏木素配方含有乙醇，显色后使用此类复染剂，可能在正式封片前就影响红色信号。因此，选择复染剂时应查看具体产品的组分和使用说明，不能仅凭“Harris苏木素”或“即用型”名称判断其是否适合AEC。

Mayer苏木素是AEC染色中常见的水性复染选择[2]。如果考虑Gill苏木素或甲基绿，也应同时确认其具体配方，以及与所用显色体系、封片剂的兼容性。复染效果与试剂组合有关，不能只根据染料名称直接替换。

酸性乙醇分化同样值得检查。即使复染液本身符合要求，后续加入含醇分化步骤，仍可能接触并溶解AEC显色产物。对于希望保留AEC红色信号的流程，应连同复染后的分化、清洗步骤一起检查，避免遗漏显色之后的含醇处理。

## 四、AEC与DAB双染，应该采用哪种封片路径？

DAB形成棕色反应产物，对常规乙醇脱水及二甲苯透明具有较好的耐受性，因此DAB染色切片可以采用相应的脱水、透明和树脂封片流程。AEC的溶剂兼容性与DAB不同，不能直接照搬这一流程[3]。

在同一张切片上使用AEC与DAB、并希望保留两种信号时，常规流程应选择兼容AEC的水性封片路径。DAB信号可以保留下来，并不意味着AEC也能耐受相同的有机溶剂处理。双染封片需要同时满足两种显色产物的要求。

选择封片方式时，关键是明确所用显色产物的性质。红色染料之间也可能存在耐醇性差异，不能仅凭颜色或以往使用其他显色剂的经验来决定是否脱水。

## 五、AEC不脱水封片，操作中应关注什么？

AEC显色完成后，按所用显色试剂的要求清洗，去除残余显色液；采用兼容的水性复染方案后，跳过梯度乙醇脱水和二甲苯透明，直接进入水性封片。这里的“不脱水”是指省去有机溶剂处理，并不意味着让大量清洗液积存在盖玻片下。

封片前应适当沥去多余液体，同时保持组织区域湿润。避免将组织吸干或使切片出现局部干燥，再滴加封片剂、缓慢放下盖玻片，尽量减少气泡。封片剂的用量、固化方式及是否需要封边，按对应产品说明执行。

例如，Polysciences Aqua-Poly/Mount属于可直接从水相进行封片的水性产品，其技术资料建议沥去多余水分，不建议吸干切片。产品干燥后可自行形成封闭边缘，通常无需额外封边[4]。这些操作特点可供选择水性封片剂时参考，但不同产品的干燥和封边要求可能不同。

## 六、为什么有些多重免疫组化文献又使用乙醇去除AEC？

在序贯多重免疫组化中，研究人员可以利用AEC可被乙醇去除的特性，在同一切片上依次完成不同标志物的染色与成像。Sundaram等人的研究在每轮AEC染色后先进行临时封片和图像采集，随后用乙醇去除AEC，为后续轮次做准备；细胞核染色在独立的最后一轮完成[1]。

![序贯多重免疫组化中各标志物的AEC显色图像及独立核染图像](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/2d58525bbe52600311654eb0eda69a3b.jpg)

**图2：序贯多重免疫组化中各标志物的AEC显色图像及独立核染图像。各标志物在不同轮次染色后分别成像，红色至橙红色为AEC显色；蓝色“Nuclei”面板为独立的苏木素核染图像。来源：参考文献[1]，图2A。**

理解这一实验目的，就能区分文献中的主动去色与常规封片时的信号丢失：前者在成像后有计划地去除上一轮显色产物，后者则需要保留切片上的AEC信号。阅读相关方案时，应把显色、成像、去色的先后顺序一起考虑。

## 七、AEC染色变浅的常见问题排查

下表用于将观察现象与待检查环节对应起来。颜色变化本身通常不能唯一确定原因，应结合处理顺序和实际试剂配方判断。

| 镜下观察到的现象 | 优先检查的可能原因 | 排查与改进方向 |
| :---: | :---: | :---: |
| 整片明显变淡，部分边缘区域更突出 | 显色后接触乙醇、二甲苯等不兼容溶剂 | 回溯复染、脱水、透明和封片步骤，采用兼容AEC的水性路径 |
| 局部颜色变浅，伴有流痕 | 封片剂与显色体系不兼容，或沥液、干燥状态不均 | 核对封片剂说明，均匀沥去多余液体，避免组织局部干燥 |
| 刚封片时颜色正常，放置数周后变浅 | 光照、光氧化或保存条件不合适 | 避光保存，并按所用染色和封片体系确定温度等条件 |
| 核染较深，红色信号不明显 | 复染过深影响对比，或含醇复染、分化步骤使AEC溶失 | 对照复染前后的图像，检查复染强度、试剂配方及分化步骤 |
| 盖玻片下出现气泡，或边缘逐渐干涸 | 盖片时带入气泡、固化不充分，或所用产品需要封边 | 规范盖片和固化操作，按产品要求决定是否封边 |

**表1：AEC染色颜色变化与封片问题的排查方向。**

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## 常见问题（FAQ）

### 1. AEC显色后可以用乙醇脱水吗？

对于需要保留常规AEC红色信号的切片，应避免显色后的乙醇脱水。AEC反应产物可溶于醇，通常采用兼容的水性复染与封片路径。

### 2. AEC封片后红色消失，需要先增加抗体浓度吗？

如果显色结束时信号正常，应先检查颜色从哪一步开始减弱，尤其关注含醇复染、乙醇脱水、二甲苯透明及封片剂兼容性，再决定是否需要调整前面的染色条件。

### 3. Mayer苏木素能用于AEC复染吗？

Mayer苏木素是常见的水性复染选择。使用时仍应对应具体产品说明，并检查后续是否包含酸性乙醇分化等含醇步骤。

### 4. 换成水性封片剂后，AEC颜色就能一直保持吗？

水性封片解决的是显色产物与封片流程的兼容性问题。保存期间仍需关注光照、封片状态和产品规定的储存条件，保存时间不能仅凭“水性”这一属性确定。

## 参考资料

[1] Sundaram S, Kim EN, Jones GM, et al. Deciphering the Immune Complexity in Esophageal Adenocarcinoma and Pre-Cancerous Lesions With Sequential Multiplex Immunohistochemistry and Sparse Subspace Clustering Approach. Frontiers in Immunology. 2022;13:874255. DOI: 10.3389/fimmu.2022.874255.

[2] Merck/Sigma-Aldrich. Immunohistochemistry Protocol：AEC显色、复染及封片相关说明。

[3] Dako. Immunohistochemical Staining Methods. 4th ed. 2006. Basic Enzymology：显色产物与封片介质相关内容。

[4] Polysciences. Aqua-Poly/Mount Technical Data Sheet，TDS 521。

## 关于技术来源

> 本文依据AEC显色、免疫组化封片相关技术资料及所引研究文献，曼博生物整理，用于组织染色与水性封片相关科研参考。曼博生物提供Polysciences水性封片剂及相关组织学试剂信息，具体操作以所用产品说明为准。

摘要： 免疫组化切片刚完成AEC显色时红色清晰，经过乙醇脱水、二甲苯透明和树脂封片后却明显变浅，这类现象需要从显色产物的溶剂兼容性入手排查。AEC形成的玫瑰红色沉淀可溶于醇等有机溶剂，常规脱水封片流程可能导致信号丢失。本文围绕AEC染色褪色、苏木素复染和水性封片等问题，说明不同阶段颜色变浅的原因及相应处理思路。

AEC显色后为什么一脱水就变浅？免疫组化复染与封片排查要点

免疫组化切片刚完成AEC显色时红色清晰，经过乙醇脱水、二甲苯透明和树脂封片后却明显变浅，这类现象需要从显色产物的溶剂兼容性入手排查。AEC形成的玫瑰红色沉淀可溶于醇等有机溶剂，常规脱水封片流程可能导致信号丢失。本文围绕AEC染色褪色、苏木素复染和水性封片等问题，说明不同阶段颜色变浅的原因及相应处理思路。

应用科学家

其他

AEC显色后遇乙醇脱水或树脂封片易褪色，需改用Mayer苏木素复染和水性封片剂；DAB双染时须兼顾两种显色产物的溶剂兼容性，保存注意避光。按颜色变化节点逐项排查，可避免信号丢失。

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