**摘要：** 将Vitronectin用于iPSC培养时，需要区分冻干蛋白复溶、包被工作液配制、培养板处理和接种后验证几个环节。Qkine重组人Vitronectin（Qk120）的参考方案采用1mg/mL储备液、5μg/mL包被工作液、不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS，并在37℃包被至少2小时，6孔板每孔使用1mL工作液。本文保留上述操作参数，说明储备液与工作液的浓度换算、单孔用量和不同板型的调整思路，并结合原厂Day 2、Day 4、Day 7形态观察及OCT4、NANOG、SOX2染色结果，讨论如何评价包被后的培养表现和排查实验间差异。

**关键词：Vitronectin包被方法、Qk120包被方案、iPSC培养板包被、玻连蛋白工作液、1mg/mL储备液、5μg/mL包被浓度、6孔板包被、无钙镁PBS、Qkine、iPSC贴附验证**

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## 一、为什么需要把复溶、包被和细胞培养分开记录

Vitronectin是iPSC无饲养层培养中常用的细胞外基质蛋白，但“使用了同一种玻连蛋白”并不意味着各次实验采用了相同操作。冻干粉怎样复溶、工作液是否配到目标浓度、每孔加入多少体积、包被温度和时间是否一致，以及接种时使用的培养基和细胞状态，都会影响对实验结果的解释。因此，建立包被流程时，应把蛋白处理、培养板处理和细胞培养分别记录，再将这些记录与实际细胞表现对应起来。

Qkine Qk120为大肠杆菌表达的截短型重组人Vitronectin，以冻干粉提供，具有AOF、无载体蛋白和无蛋白标签等特点。所引资料列出的质量指标包括SDS-PAGE定量分析纯度＞98%、内毒素＜0.05 EU/μg protein和蛋白回收率＞95%，可用于核对所使用材料的身份与质量信息。不过，这些指标并不替代实验室对复溶、包被及培养表现的记录；同一产品在不同细胞系或培养体系中的适用条件仍需验证。

## 二、Qk120培养板包被的参考条件有哪些

所引资料中的Qk120方案采用1mg/mL储备液，并使用不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS配制5μg/mL工作液。对于6孔板，每孔加入1mL工作液，在37℃包被至少2小时。下表保留原始参数及对应关系，实际执行应结合所用产品说明和实验室验证结果。

| 项目 | 推荐条件 |
| :---: | :---: |
| 储备液浓度 | 1mg/mL |
| 工作液浓度 | 5μg/mL |
| 稀释液 | 不含 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 PBS |
| 包被温度 | 37℃ |
| 包被时间 | 至少 2 小时 |
| 6 孔板单孔用量 | 1mL 工作液 |

**表1：Qk120培养板包被参考参数。**

其中，储备液是复溶后的较高浓度蛋白溶液，工作液是用于培养板包被的稀释液，两者不能混用。官方产品说明将复溶与包被稀释作为不同步骤：冻干蛋白按说明用无菌过滤水配成储备液，再用无钙镁PBS稀释至包被浓度。因此，表中的PBS指向工作液稀释环节，不能因为表格列出PBS，就自行认定它也是冻干粉的复溶液。

同样，37℃至少2小时描述的是培养板包被条件，1mL描述的是6孔板单孔包被用量，不能将这些参数直接套用为细胞接种后的培养操作。包被完成后的具体衔接步骤、培养基用量和传代方式，应按相应产品说明及已经验证的培养流程执行，不能仅凭这张参数表补齐所有细胞培养细节。

## 三、1mg/mL储备液如何换算成5μg/mL工作液

配液时需要先统一单位。1mg/mL等于1,000μg/mL，目标工作液浓度为5μg/mL，因此对应200倍稀释。按照浓度与体积关系C₁V₁＝C₂V₂计算，配制1mL工作液需要5μL的1mg/mL储备液，再加入995μL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS，得到总量1,000μL的工作液。这里的200倍稀释指1份储备液对应200份最终溶液，即1份储备液加199份稀释液。

若6孔板的6个孔均按1mL/孔包被，理论上需要6mL工作液，对应30μL储备液加5,970μL PBS。按5μg/mL计算，每孔投入的蛋白量为5μg，整板为30μg。上述数值是根据所引资料参数得到的配液换算，没有计入移液、容器残留或其他操作损耗，也不代表最终固定在培养表面的蛋白量；实际配制体积应结合已验证流程合理安排。

| 配制目标 | 1mg/mL储备液 | 无钙镁PBS | 工作液总体积 | 蛋白总量 |
| :---: | :---: | :---: | :---: | :---: |
| 6孔板1个孔 | 5μL | 995μL | 1mL | 5μg |
| 6孔板6个孔 | 30μL | 5,970μL | 6mL | 30μg |

**表2：根据1mg/mL储备液、5μg/mL工作液和1mL/孔计算的理论配液量，未计操作损耗。**

这类换算有助于减少将mg与μg混淆、将储备液浓度当作工作浓度等记录错误，但准确配液只是流程的一部分。即使计算正确，仍需核对储备液的实际浓度、所用稀释液以及包被条件；如果起始储备液并非1mg/mL，就需要重新计算，不能继续沿用表2中的取液体积。

## 四、换用其他板型时，为什么不能只照搬1mL/孔

所引资料明确提出，不同培养板规格可根据培养面积调整包被液体积。因此，1mL/孔属于6孔板参考条件，不应直接应用于所有孔板。工作液浓度、单孔加入体积和培养面积共同决定单位面积投入的蛋白量：在浓度不变时，体积变化会改变每孔加入的总量；在总体积不变时，培养面积变化也会改变单位面积的投入量。记录中同时保留浓度、体积和板型，比只写“Vitronectin 5μg/mL”更完整。

需要区分的是，按浓度乘体积计算得到的蛋白质量，描述的是投入包被步骤的量，不能直接视为实际吸附到表面的量。所引资料没有提供不同板型的吸附效率数据，也没有给出所有培养面积的通用换算表。因此，改变板型时应依据对应说明调整体积，并确认液体能够按所用流程覆盖培养表面，再通过细胞表现验证条件是否适用，避免仅凭一个浓度数值推断包被效果完全一致。

Qkine另有Qk120预包被6孔板，可作为不同使用形式加以考虑。但预包被板与实验室现场包被的操作流程并不相同，不能仅因使用同类蛋白就直接沿用其储存和处理方式。对于所引资料未给出的包被板保存期限、洗涤次数或重复使用条件，应查阅具体产品说明，而不应从其他Vitronectin产品的操作经验中直接移植。

## 五、包被完成后，如何观察iPSC是否获得适宜的贴附与集落生长

评价包被效果需要回到细胞培养结果。所引资料中的原厂实验使用5μg/mL Qk120包被，并在E8-like培养基中培养iPSC：Day 2可观察到贴附细胞及初步集落，Day 4形成较明显集落、传代前汇合度约85%，Day 7仍保持集落生长、传代前汇合度约75%。这组结果说明，在所述材料和培养条件下，研究人员观察到了支持iPSC贴附及后续培养的表现，可作为实验室建立验证指标时的参考。

![Qk120与VTN-N A14700包被条件下iPSC的不同时间点形态](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/d1a627009c64f8b9eea2d81ee433aff1.jpg)

**图1：Qkine VTN（Qk120）与Thermo Scientific VTN-N（A14700）包被条件下iPSC在Day 2、Day 4和Day 7的显微镜照片。实验结果由Qkine提供。**

实际比较时，应尽量将观察结果与接种时间、传代节点和细胞初始状态对应起来。上述85%和75%是原厂所述节点的观察值，不是所有iPSC实验必须达到的统一标准，也不能单独用于计算扩增倍数。若实验室看到的集落形态与原厂照片不同，应结合培养背景分析，而不能只根据照片差异认定包被失败；同样，看到集落生长也不等于已经完成对细胞状态的全部验证。

## 六、为什么包被验证还需要观察多能性相关标志物

对于以维持iPSC状态为目标的培养，贴附和集落生长之外，还应关注多能性相关特征。Qkine在Qk120包被培养的细胞中检测了OCT4、NANOG及SOX2，所引资料中的免疫荧光图像显示了相应表达。将这些结果与形态观察结合，可以从不同维度评价培养后的细胞，而不只依赖是否铺满培养表面来判断条件是否合适。

![Qk120培养的iPSC的OCT4与NANOG免疫荧光结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/cec2553f8e60d5d186d7686ce19261aa.jpg)

**图2：Qk120培养的iPSC的OCT4、NANOG免疫荧光染色。所有图像均使用EVOS M5000在20倍放大下拍摄，实验结果由Qkine提供。**

**分图说明：**（A）明场成像；（B）NANOG、OCT4与Hoechst；（C）NANOG与Hoechst；（D）OCT4与Hoechst；（E）Hoechst；（F）NANOG；（G）OCT4。

![Qk120培养的iPSC的SOX2免疫荧光结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/af2882887b7b9ea1c09f4b4533a290c4.jpg)

**图3：Qk120培养的iPSC的SOX2免疫荧光染色。所有图像均使用EVOS M5000在20倍放大下拍摄，实验结果由Qkine提供。**

**分图说明：**（A）明场成像；（B）SOX2与Hoechst染色；（C）SOX2。

需要注意，代表性免疫荧光图像不能直接提供整个培养物的阳性比例，也不能代替长期培养或下游分化功能数据。若研究目标从常规扩增转向神经、中胚层等定向分化，或进入类器官体系开发，评价终点就需要随之调整。原厂iPSC培养图像可以支持基质选择的初步判断，但不能替代目标体系自身的验证。

## 七、出现批次差异时，可以从哪些记录开始核对

在已经采用Qk120的实验中，如果不同批次的贴附或集落生长表现不一致，可先核对蛋白处理与包被记录，包括产品及批次身份、复溶方式、储备液实际浓度、工作液计算、PBS是否符合方案要求、板型和单孔体积，以及包被温度和时间。这样做的目的是确认各次实验是否真正执行了相同条件，并不能预先认定差异一定来自基质蛋白。

随后需要将细胞与培养条件纳入比较，包括细胞系、接种前状态、传代操作、培养基及观察时间点。所引资料中的实验使用E8-like培养基，因此其他培养基条件下的结果需要结合各自体系解释。若一次实验同时改变了基质、培养基和传代方法，仅凭最终集落照片通常难以判断是哪一项变化起主要作用；更清晰的比较需要尽量控制其他条件，并把形态观察与适当的标志物检测结合起来。

上述核对思路来自所引资料中的关键材料、操作参数和培养评价维度，不是针对所有贴附问题都已验证有效的修复方案。尤其不应在缺少比较数据时直接认定提高包被浓度就一定能够改善培养，或把单次观察到的差异解释为某个产品批次存在质量问题。完整记录能够帮助缩小待验证范围，具体原因仍需要实验确认。

## 八、怎样形成可复核的Qk120包被与培养记录

一份有用的包被记录，应能够说明使用了什么材料、怎样配制工作液、在什么培养表面完成包被，以及接种后观察到了什么结果。以所引资料方案为起点，可以将1mg/mL储备液、5μg/mL工作液、无钙镁PBS、37℃至少2小时和6孔板1mL/孔作为明确的参数记录，再将这些信息与细胞来源、培养基和后续形态及标志物检测关联。这样既便于实验复核，也便于在出现差异时定位需要进一步比较的环节。

Qk120包被方案提供的是一个有原厂培养数据支持的参考条件，具体实验仍应围绕目标细胞系建立适用性证据。准确配液、合理调整板型用量和保留培养记录，有助于提高操作的一致性；细胞贴附、集落生长及多能性相关检测，则用于判断这些操作是否达到了实际研究目标。

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## 九、常见问题（FAQ）

### 1. 1mg/mL储备液配成5μg/mL工作液，需要稀释多少倍？

需要稀释200倍。将1mg/mL换算为1,000μg/mL后，再除以目标浓度5μg/mL，即得到200。按最终体积计算，5μL储备液加995μL PBS可配成1mL工作液；只有储备液实际浓度确为1mg/mL时，才适用这一取液量。

### 2. 6孔板每孔5μg蛋白，是否就是表面实际包被了5μg？

不是。每孔5μg是根据5μg/mL工作液和1mL加入体积计算的投入量，实际固定在培养表面的量还涉及包被过程。所引资料没有提供吸附率或最终表面蛋白量的测定结果，因此不能把理论加入量直接写成已经测得的表面负载量。

### 3. 能否把6孔板的1mL/孔直接用于其他板型？

不应直接照搬。不同板型的培养面积不同，单孔包被液体积需要按对应说明调整，并结合实际覆盖情况和细胞表现验证。记录工作浓度时还应同时注明板型和体积，否则相同的5μg/mL并不能完整描述单位培养面积所接触的蛋白投入量。

### 4. 细胞已经贴附，是否可以省略多能性标志物检测？

如果研究目标包括维持iPSC的多能性相关状态，仅凭贴附或集落形态不足以完成评价。OCT4、NANOG、SOX2等检测提供了不同于形态观察的信息，应根据研究目的纳入适当验证；对于长期培养和定向分化，还需进一步考虑相应的质量与功能终点。

## 资料来源

[1] Qkine. Recombinant human vitronectin protein（Qk120）产品资料及培养板包被说明。

[2] Qkine提供的Qk120 iPSC培养验证图像：Day 2、Day 4、Day 7形态观察，以及OCT4、NANOG、SOX2免疫荧光结果。

> 本文基于Qkine Qk120产品资料、包被参考方案及原厂iPSC培养验证数据，用于Vitronectin培养板包被及相关科研流程参考。200倍稀释、单孔5μg和整板30μg为基于所列参数的理论换算，未计操作损耗，也不代表实测表面蛋白量。具体复溶、包被和培养操作以对应产品说明及实验室验证结果为准。

摘要： 将Vitronectin用于iPSC培养时，需要区分冻干蛋白复溶、包被工作液配制、培养板处理和接种后验证几个环节。Qkine重组人Vitronectin（Qk120）的参考方案采用1mg/mL储备液、5μg/mL包被工作液、不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS，并在37℃包被至少2小时，6孔板每孔使用1mL工作液。本文保留上述操作参数，说明储备液与工作液的浓度换算、单孔用量和不同板型的调整思路，并结合原厂Day 2、Day 4、Day 7形态观察及OCT4、NANOG、SOX2染色结果，讨论如何评价包被后的培养表现和排查实验间差异。

Vitronectin怎么包被iPSC培养板？Qk120工作液配制、包被条件与验证要点

将Vitronectin用于iPSC培养时，需要区分冻干蛋白复溶、包被工作液配制、培养板处理和接种后验证几个环节。Qkine重组人Vitronectin（Qk120）的参考方案采用1mg/mL储备液、5μg/mL包被工作液、不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS，并在37℃包被至少2小时，6孔板每孔使用1mL工作液。本文保留上述操作参数，说明储备液与工作液的浓度换算、单孔用量和不同板型的调整思路……

应用科学家

其他

重组人Vitronectin（Qk120）用于iPSC培养的包被方案：1mg/mL储备液以无钙镁PBS稀释200倍至5μg/mL工作液，6孔板每孔1mL，37℃包被至少2小时。通过Day2-7形态观察及OCT4、NANOG、SOX2表达验证，结合板型换算与多能性标志物检测，确保iPSC贴附与培养质量。

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