小鼠UACR检测：尿白蛋白与肌酐实验流程|ELISA试剂盒

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小博聊生物

发布于 2026-07-31 10:10:55

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摘要：尿白蛋白/肌酐比值（UACR）通过同步检测同一份尿液样本中的白蛋白和肌酐，对尿液浓缩或稀释造成的波动进行校正，是小鼠肾损伤、糖尿病肾病、药物肾毒性和遗传性肾病研究中常用的无创监测指标。本文围绕小鼠UACR检测的完整流程，解析Albuwell M直接竞争性ELISA检测尿白蛋白和Creatinine Companion改良Jaffe法检测尿肌酐的基本原理，并详细整理尿液采集、样本保存、稀释比例、标准曲线、显色读数、结果换算及数据解读中的关键问题，为小鼠肾功能研究中的尿液指标检测提供实验参考。

关键词：UACR、尿白蛋白肌酐比值、小鼠肾功能检测、尿白蛋白检测、尿肌酐检测、糖尿病肾病、肾损伤、Jaffe法、Albuwell M检测、药物肾毒性

一、小鼠肾功能研究为什么需要检测UACR

在小鼠肾损伤、糖尿病肾病、药物肾毒性和遗传性肾病研究中，尿液样本具有采集创伤较小、能够重复获取和适合纵向观察等特点。研究者可以在不同实验时间点采集同一只动物的尿液，持续观察肾脏滤过屏障功能、蛋白排泄水平及干预措施产生的变化，从而减少仅依赖终点组织检测所带来的局限。

正常情况下，肾小球滤过屏障能够限制白蛋白等大分子蛋白进入尿液。当肾小球内皮、基底膜或足细胞结构与功能发生变化时，尿白蛋白排泄可能增加。因此，尿白蛋白是评价肾小球滤过屏障完整性和肾损伤模型表型的重要指标之一。

不过，尿液并不是浓度恒定的体液。动物饮水量、排尿量、采样时间、环境温度、代谢状态以及采样方式都会影响尿液浓缩程度。即使两只小鼠实际排出的白蛋白总量相近，如果其中一份尿液更加浓缩，其检测得到的白蛋白浓度也可能明显升高。仅比较尿白蛋白绝对浓度，难以判断差异究竟来自肾脏蛋白排泄增加，还是来自尿液浓缩程度不同。

尿白蛋白/肌酐比值的基本思路，是在同一份尿液中分别测定白蛋白和肌酐，再以肌酐浓度对白蛋白结果进行归一化。肌酐在一定条件下可以作为尿液浓缩程度的参考，因此，UACR比单独的尿白蛋白浓度更适合随机尿或点尿样本之间的比较，也常用于同一动物在不同时间点的纵向监测。

需要注意的是，UACR并不能完全替代24小时尿白蛋白排泄量。小鼠的肌酐生成和排泄会受到品系、性别、年龄、体重及肌肉量影响，因此，UACR更适合用于同一模型体系内的组间比较，而不适合脱离实验背景进行跨品系的绝对数值判断。

二、UACR需要分别完成两项独立检测

UACR不是由单一试剂直接测得，而是由尿白蛋白和尿肌酐两项检测结果计算获得。小鼠研究中可使用Albuwell M检测尿白蛋白，并使用Creatinine Companion检测尿肌酐。两项检测均采用96孔板格式，可以对同一批尿液样本进行平行分析。

Albuwell M使用直接竞争性ELISA原理进行小鼠白蛋白定量，而Creatinine Companion采用改良碱性苦味酸法，也就是在经典Jaffe法基础上通过加酸前后的吸光度差值降低非肌酐色原干扰。两种检测的反应机制、标准曲线和样本稀释方式并不相同，因此需要分别完成实验，再统一单位计算UACR。

为了保证最终比值具有可比性，尿白蛋白和尿肌酐应尽量使用同一份经过充分混匀的尿液样本。若两项检测使用不同时间采集或经过不同冻融处理的样本，可能引入额外误差。样本量有限时，应在实验开始前根据两种方法的加样量、稀释比例和复孔数量做好分装规划。

三、Albuwell M竞争性ELISA检测尿白蛋白的原理

Albuwell M采用直接竞争性抗体捕获ELISA原理，微孔板表面预包被小鼠白蛋白。检测时，将待测尿液样本和辣根过氧化物酶标记的抗小鼠白蛋白抗体加入孔中，尿液中的游离白蛋白与固相包被白蛋白竞争结合酶标抗体。

当尿液样本中的白蛋白浓度较高时，更多酶标抗体会在液相中与样本白蛋白结合，能够结合到固相包被白蛋白上的酶标抗体相应减少。经过洗板去除未结合成分后，孔内保留的HRP数量较少，加入TMB底物后的显色强度也较低。因此，该方法的吸光度与样本白蛋白浓度呈反向关系，与常见夹心ELISA中浓度越高、吸光度越高的模式不同。

显色完成后加入硫酸终止反应，并在450 nm波长下读取吸光度。原始实验方案采用0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5和10 μg/mL七个标准浓度点建立标准曲线。由于吸光度与白蛋白浓度的对数呈反向关系，可使用白蛋白浓度的log₁₀值作为横轴，以平均吸光度作为纵轴进行半对数拟合。

竞争性ELISA对标准品、样本和酶标抗体的加样时间较为敏感。如果同一块板不同孔之间的操作间隔过长，实际反应时间就会出现差异。因此，在样本数量较多时，应提前规划加样顺序，并尽量使用多道移液器缩短孔间时间差。

图1. Albuwell M小鼠白蛋白ELISA检测试剂盒，货号1011

四、改良Jaffe法检测尿肌酐的原理

Creatinine Companion基于经典Jaffe碱性苦味酸反应。在碱性条件下，肌酐与苦味酸形成有色复合物，可通过吸光度变化进行定量。传统终点Jaffe法容易受到尿液中其他可显色成分影响，导致检测结果偏高或重复性下降。

该方法通过加酸前后两次读取吸光度进行校正。首先，尿液样本中的肌酐在碱性苦味酸条件下形成有色复合物，读取第一次吸光度；随后加入酸试剂，使肌酐与苦味酸形成的复合物分解，再读取第二次吸光度。部分非肌酐色原的显色在加酸前后变化较小，因此，两次吸光度的差值可以更有针对性地反映肌酐相关信号。

每个样本的差值按照“初次吸光度减去加酸后的第二次吸光度”计算，即ΔAbs=Abs₁-Abs₂。以1、3和10 mg/dL三个肌酐标准品浓度为横轴，以对应ΔAbs为纵轴建立线性回归曲线，再将样本差值代入计算稀释后的肌酐浓度。

与免疫学检测不同，改良Jaffe法不依赖抗体，因此操作相对快速，适合批量尿液样本检测。但该方法仍需保持碱性苦味酸工作液配制、反应时间、读取波长和加酸时间的一致性。工作液应按照说明现配现用，避免放置时间不同造成背景变化。

图2. Creatinine Companion尿肌酐检测试剂盒，货号1012

五、小鼠尿液样本的采集方式

小鼠尿液可采用24小时代谢笼收集，也可以采集随机尿或点尿。不同采样方式适合解决的问题不同，实验设计时应根据研究目的、动物数量和可操作条件进行选择，并保证同一比较实验中采样方式一致。

24小时尿样通常使用代谢笼收集，可以记录完整时间段内的尿液体积和白蛋白排泄总量，更适合评价每日尿白蛋白排泄。不过，代谢笼操作时间较长，动物受到的环境变化和应激也可能影响饮水、进食与排尿，因此需要设置适应时间，并保持收集条件一致。

随机尿或点尿可通过腹部轻柔刺激或其他规范方式采集，操作较为便捷，适合多时间点纵向监测。但点尿的浓缩程度变化较大，因此通常需要结合尿肌酐计算UACR。不同时间段的尿液浓度可能存在差异，若实验关注轻微变化，应尽量固定每日采样时间。

采样过程中应避免食物、垫料和粪便进入尿液。存在明显血液或其他体液污染的样本不宜继续用于白蛋白检测，因为血液中的白蛋白浓度远高于正常尿液，少量污染即可导致结果明显升高。若样本颜色、透明度或沉淀状态异常，应在检测前做好记录并评估是否剔除。

六、尿液样本的处理与保存

尿液采集后通常不添加防腐剂。若样本中存在明显颗粒或沉淀，可通过适当离心进行澄清，再取上清用于检测。不同样本应使用相同离心条件，避免处理差异影响最终结果。

原始实验资料建议尿液在4℃条件下短期保存，时间不超过1周；长期保存可置于-60℃，时间不超过2个月。样本应根据单次检测所需体积提前分装，减少重复冻融。解冻时应在室温下自然恢复，不建议采用加热方式快速解冻。

检测前，所有样本应恢复至室温并充分混匀。冷冻过程中，蛋白质、盐类和其他组分可能出现分层或局部浓度差异，如果解冻后直接从上层吸取，会增加孔间和样本间误差。混匀后如再次出现沉淀，可按照预先确定的离心方式处理。

尿白蛋白与尿肌酐最好使用同一次解冻的分装样本完成检测。若第一次检测结果超出标准曲线范围，需要重新调整稀释比例时，也应尽量使用相同冻融次数的样本。

七、尿白蛋白ELISA的标准品和样本稀释

Albuwell M标准品使用NHEBSA稀释液进行连续1:2倍比稀释，获得0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5和10 μg/mL七个浓度点。标准品应设置复孔，以便评价孔间差异并提高标准曲线稳定性。

常规尿液样本可先采用1:21稀释，即将10 μL尿液加入200 μL稀释液。由于不同小鼠模型、疾病阶段和处理组之间的尿白蛋白浓度可能差异很大，首次建立实验时可同时测试原液、1:21和1:81三个稀释度，从中选择吸光度能够落入标准曲线有效范围的结果。

竞争性ELISA中，高浓度样本对应低吸光度。如果样本吸光度低于最高浓度标准品对应的范围，说明白蛋白浓度可能过高，需要增加稀释倍数；如果样本吸光度接近空白或低浓度标准品，则可能需要降低稀释倍数。

每一份尿液样本都应更换新的移液吸头，防止高浓度样本残留污染后续样本。对于模型组与对照组浓度差异较大的实验，可将预期高浓度样本安排在后面加样，进一步降低交叉影响。

八、尿白蛋白ELISA的反应、洗板与读数

所有试剂、标准品和尿液样本应提前平衡至室温。实验中设置阴性对照、阳性对照和标准品复孔，尿液样本也建议使用复孔。复孔差异过大通常提示移液、洗板或样本混匀存在问题，不宜只保留其中一个数值。

除阴性对照孔外，按照实验说明向各孔加入酶标抗体，封板后在室温孵育30分钟。孵育期间应避免阳光直射和温度剧烈变化，也不宜随意延长部分孔的反应时间。

反应结束后进行10个循环的洗板。洗板的目的是去除未结合的样本成分和酶标抗体，洗涤不足会造成背景偏高，而残留液体过多也会影响后续显色液浓度。原始资料说明可使用自来水洗板，在实验条件不适合时也可使用配套TEA洗板缓冲液。无论选择哪种方式，同一批实验应保持一致。

洗板完成后加入TMB显色液，在室温反应5—10分钟，再加入终止液。在450 nm处读取吸光度，并以阴性对照孔作为空白。由于显色反应持续进行，加入终止液和读板的顺序应保持稳定，避免不同孔之间出现较大的时间差。

图3. 小鼠尿白蛋白竞争性ELISA实验流程

九、尿白蛋白结果的计算方法

标准曲线以log₁₀白蛋白浓度为横轴，以标准品平均吸光度为纵轴进行半对数线性拟合。由于该方法属于竞争性ELISA，标准曲线应随白蛋白浓度升高而呈吸光度下降趋势。如果曲线方向异常，应检查标准品稀释、酶标抗体和加样顺序。

将样本平均吸光度代入标准曲线方程，可得到对应的log₁₀浓度，再取反对数获得稀释后尿液中的白蛋白浓度。最后乘以样本实际稀释倍数，得到原始尿液白蛋白浓度。

若复孔之间差异明显，应先检查是否存在气泡、孔底污染、移液偏差或洗板不均。若某个样本吸光度落在标准曲线范围之外，不宜进行远距离外推，而应调整稀释倍数后重新检测。

所有结果计算应保留原始吸光度、稀释倍数、标准曲线方程和拟合情况，便于后续复核。不同实验批次之间比较时，还应关注标准曲线斜率和对照样本表现是否稳定。

十、尿肌酐检测的样本稀释和反应流程

尿肌酐检测通常使用蒸馏水将样本稀释1:20。由于不同样本肌酐浓度可能存在差异，仍需要根据初次结果调整稀释倍数，确保ΔAbs落在1、3和10 mg/dL标准品建立的线性范围内。

检测前将0.5 M NaOH与苦味酸试剂按要求混合，配制碱性苦味酸工作液，并在规定时间内使用。每孔加入20 μL标准品或稀释后的尿液样本，设置空白孔、三个浓度标准品复孔和样本复孔。

随后，每孔加入100 μL碱性苦味酸工作液，室温静置10分钟，在规定波长下读取第一次吸光度。完成第一次读数后，每孔加入100 μL酸试剂，室温静置5分钟，再在相同波长下读取第二次吸光度。

加酸前后的反应时间必须保持一致。若样本数量较多，应按照固定间隔分批加样，并以相同顺序完成两次读数，避免部分孔反应时间明显延长。读板前应检查孔内是否存在气泡，气泡会直接干扰吸光度结果。

图4. 小鼠尿肌酐改良Jaffe法检测流程

十一、尿肌酐结果的计算方法

每个标准品和样本孔分别计算加酸前后的吸光度差值，即ΔAbs=第一次吸光度-第二次吸光度。空白孔可用于评价试剂本底，并按照实验说明进行相应处理。

以肌酐标准品浓度为横轴，以对应平均ΔAbs为纵轴进行线性回归。将样本ΔAbs代入回归方程，得到稀释后样本的肌酐浓度，再乘以实际稀释倍数，得到原始尿液肌酐浓度。

如果样本ΔAbs低于最低标准品或高于最高标准品，不宜直接外推。浓度过高时可以增加稀释倍数，浓度过低时则需要减少稀释倍数，并保证重新检测时的所有反应条件一致。

改良Jaffe法通过两次读数降低非肌酐色原影响，但并不能消除所有尿液基质差异。因此，在比较不同模型时，应保持样本处理、稀释液、反应时间和试剂批次一致，并使用稳定的内部质量控制样本监测实验表现。

十二、UACR的换算方法与单位

UACR由同一份尿液样本中的白蛋白浓度除以肌酐浓度得到。计算前必须先统一两项结果的质量单位，避免因μg、mg或dL、mL混用造成数量级错误。

小鼠实验中常用的UACR单位包括μg/mg和mg/g，两种单位的数值相等，即1 mg/g等于1 μg/mg。例如，当尿白蛋白浓度以μg/mL表示、尿肌酐浓度以mg/mL表示时，两者直接相除即可得到μg/mg。

若尿肌酐检测结果为mg/dL，需要先换算为mg/mL，再与尿白蛋白的μg/mL单位相匹配。所有换算步骤应在数据表中明确记录，避免只保留最终UACR值而无法复核原始计算。

对于24小时尿液样本，除计算UACR外，还可以结合总尿量计算24小时尿白蛋白排泄量。两项指标反映的角度不同，同时报告有助于更完整地描述模型表型。

十三、UACR结果受到小鼠品系和个体特征影响

小鼠肌酐生成与肌肉代谢密切相关，不同品系、性别、年龄、体重和肌肉量会影响尿肌酐排泄。即使两组动物的尿白蛋白排泄水平相近，肌酐差异也可能使最终UACR出现变化。

因此，UACR更适合用于同一品系、相近年龄和相同性别动物之间的组间比较，也适合对同一动物进行不同时间点追踪。跨品系比较时，不能仅依据UACR绝对值判断哪一品系肾损伤更严重，还应同时观察尿白蛋白绝对浓度和24小时排泄量。

动物体重和肌肉量在长期实验中也可能发生变化。例如，严重代谢异常或消耗状态可能降低肌酐生成，使UACR在尿白蛋白变化不大的情况下升高。解读长期干预结果时，应将体重、整体代谢和动物状态纳入分析。

十四、点尿UACR与24小时尿白蛋白并不完全一致

点尿UACR通过肌酐对尿液浓缩程度进行校正，具有采样方便和适合重复检测的优势，但其结果与24小时尿白蛋白排泄量并非完全一致。造成差异的原因包括尿白蛋白和肌酐在不同时间段的排泄节律，以及不同小鼠品系的肌酐排泄特征。

原始资料提到，糖尿病并发症动物模型研究中可同时报告24小时尿白蛋白排泄量和UACR。前者能够反映完整时间段内的白蛋白总排泄，后者更适合随机尿和纵向监测。两项指标相互补充，可以减少仅依据单次点尿得出结论的风险。

如果UACR与24小时排泄量变化方向不一致，应检查尿液采集完整性、肌酐水平、动物体重和样本污染等因素，而不宜直接选择其中一个结果进行解释。

十五、影响UACR的常见干扰因素

尿路感染、明显高血糖、严重高血压、充血性心力衰竭等状态都可能改变尿白蛋白或肌酐排泄。运动、水负荷、采样时间和动物应激也会影响尿液浓度及肾脏血流，因此，实验组和对照组应尽量在相同条件下采样。

尿白蛋白ELISA样本中不宜含有叠氮化钠等可能抑制HRP活性的成分，否则会影响TMB显色并造成结果异常。发生严重微生物污染的尿液也可能改变样本成分或影响检测反应，不宜继续使用。

若尿液存在明显血液污染，白蛋白结果可能严重偏高。对于颜色异常但无法确定污染程度的样本，可结合其他指标进行判断，并在数据分析前制定统一的剔除标准，避免根据实验结果选择性排除样本。

样本反复冻融、长时间室温放置或不同批次采用不同离心条件，同样会增加结果波动。纵向研究应在实验开始前固定样本处理和保存流程。

十六、UACR不能单独代表完整肾功能

UACR主要反映尿白蛋白排泄相对于尿肌酐的水平，更侧重于肾小球滤过屏障和蛋白尿表型。部分肾小管损伤、间质炎症或早期功能变化可能不会立即表现为明显白蛋白尿，因此，UACR不能作为肾功能评价的唯一指标。

较完整的肾脏表型评价可以同时报告尿白蛋白绝对浓度、24小时尿白蛋白排泄总量和UACR。对于滤过功能，可结合菊粉清除、FITC-司替星经皮检测或碘海醇清除等方法评估肾小球滤过率。

肌酐清除率可能受到肾小管分泌肌酐的影响。原始资料指出，部分小鼠品系中肾小管分泌肌酐的比例可达到50%，从而导致肌酐清除率高估实际GFR，因此不宜将其作为唯一的标准方法。

肾组织病理可以进一步评价系膜基质扩张、肾小球基底膜厚度、足细胞数量和肾小管间质纤维化。结合肾小管损伤标志物、炎症与纤维化分子指标及整体代谢表型，可以更全面地解释UACR变化的病理基础。

十七、常见问题

Q1：为什么检测尿白蛋白后还要检测尿肌酐？

单独的尿白蛋白浓度容易受到尿液浓缩或稀释影响。同步检测肌酐并计算UACR，可以对不同样本的尿液浓度差异进行一定程度的校正，更适合随机尿和点尿样本之间的比较。

Q2：点尿样本是否必须计算UACR？

点尿受饮水量、排尿时间和浓缩程度影响较大，通常建议结合肌酐计算UACR。如果研究条件允许，还可同时收集24小时尿液并计算白蛋白排泄总量，以提高结果完整性。

Q3：Albuwell M为什么是白蛋白越高、吸光度越低？

该方法采用竞争性ELISA。样本中的白蛋白会与微孔板包被白蛋白竞争酶标抗体。样本白蛋白越多，留在固相上的酶标抗体越少，最终显色越弱，因此吸光度与白蛋白浓度呈反向关系。

Q4：尿白蛋白样本应该采用多大稀释倍数？

常规可从1:21稀释开始。首次检测时可同时测试原液、1:21和1:81，使至少一个稀释度落入0.156—10 μg/mL标准曲线范围。模型组白蛋白水平较高时，可能需要进一步增加稀释倍数。

Q5：UACR升高是否能够直接证明肾功能严重下降？

不能。UACR升高提示单位肌酐背景下白蛋白排泄增加，但还会受到肌酐生成、动物状态和采样条件影响。应结合24小时尿白蛋白、GFR、肾组织病理及其他损伤指标进行综合判断。

十八、总结

UACR通过同步检测尿白蛋白和尿肌酐，对尿液浓缩或稀释造成的波动进行校正，是小鼠肾损伤、糖尿病肾病和药物肾毒性研究中常用的纵向监测指标。Albuwell M使用直接竞争性ELISA定量尿白蛋白，Creatinine Companion则通过改良Jaffe法及加酸前后吸光度差值检测尿肌酐，两项结果统一单位后即可计算UACR。

实验结果的稳定性取决于尿液采集、污染控制、保存条件、样本稀释、标准曲线、反应时间、洗板和读数等多个环节。竞争性ELISA中白蛋白浓度与吸光度呈反向关系，尿肌酐检测则需要准确控制两次读数和加酸时间。超出标准曲线范围的样本应重新调整稀释比例，不宜直接外推。

UACR存在品系、性别、年龄、肌肉量和采样条件等方面的局限，因此更适合在同一模型体系内进行组间比较和纵向追踪。将UACR与尿白蛋白绝对浓度、24小时排泄量、GFR、肾组织病理及肾小管损伤指标结合，能够形成更完整的小鼠肾功能评价体系。