Scanpy 分析 scRNA-seq数据|质控

预处理和聚类

# Core scverse libraries
import scanpy as sc
import anndata as ad

# Data retrieval
import pooch

sc.settings.set_figure_params(dpi=50, facecolor="white")

在本文中，使用的数据来源于健康人类供体的骨髓单核细胞，这些数据属于 openproblem 的 NeurIPS 2021 基准数据集。这些样本是通过 10X Multiome 基因表达和染色质可及性试剂盒进行测量的。

将计数矩阵导入到 AnnData 对象中，该对象为数据注释和不同数据表示方式提供了多个存储位置。

EXAMPLE_DATA = pooch.create(
    path=pooch.os_cache("scverse_tutorials"),
    base_url="doi:10.6084/m9.figshare.22716739.v1

/", ) EXAMPLE_DATA.load_registry_from_doi() samples = { "s1d1": "s1d1_filtered_feature_bc_matrix.h5", "s1d3": "s1d3_filtered_feature_bc_matrix.h5", } adatas = {} for sample_id, filename in samples.items(): path = EXAMPLE_DATA.fetch(filename) sample_adata = sc.read_10x_h5(path) sample_adata.var_names_make_unique() adatas[sample_id] = sample_adata adata = ad.concat(adatas, label="sample") adata.obs_names_make_unique() print(adata.obs["sample"].value_counts()) adata

这些数据包含每个样本大约 8,000 个细胞和 36,601 个测量的基因。接下来，将通过基础的预处理和聚类流程来分析这些数据。

质量控制

scanpy 的 calculate_qc_metrics() 函数用于计算常见的质量控制指标，这些指标主要基于 scater 中的 calculateQCMetrics。可以通过将特定基因群体传递给该函数，来计算这些基因群体的计数比例。线粒体基因、核糖体基因和血红蛋白基因分别由不同的前缀来定义。

# mitochondrial genes, "MT-" for human, "Mt-" for mouse
adata.var["mt"] = adata.var_names.str.startswith("MT-")
# ribosomal genes
adata.var["ribo"] = adata.var_names.str.startswith(("RPS", "RPL"))
# hemoglobin genes
adata.var["hb"] = adata.var_names.str.contains("^HB[^(P)]")

sc.pp.calculate_qc_metrics(
    adata, qc_vars=["mt", "ribo", "hb"], inplace=True, log1p=True
)

可以查看一些 QC 指标的提琴图，包括：

• 计数矩阵中表达的基因数量
• 每个细胞的总计数
• 线粒体基因中的计数百分比

sc.pl.violin(
    adata,
    ["n_genes_by_counts", "total_counts", "pct_counts_mt"],
    jitter=0.4,
    multi_panel=True,
)

此外，通过观察按线粒体基因计数百分比（pct_counts_mt）着色的散点图，可以更全面地评估 QC 指标之间的关系。

sc.pl.scatter(adata, "total_counts", "n_genes_by_counts", color="pct_counts_mt")

根据 QC 指标的图表，可以设置手动或自动阈值，以移除那些表达过多线粒体基因或总计数过多的细胞。然而，有时看似质量不佳的指标可能是由真实的生物学现象引起的，因此建议先采用较为宽松的过滤策略，稍后再重新评估。因此，目前仅过滤掉表达少于 100 个基因的细胞，以及在少于 3 个细胞中被检测到的基因。

另外，对于包含多个批次的数据集，建议对每个样本分别进行质量控制，因为不同批次之间的质量控制阈值可能会有很大差异。

sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=100)
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)

双细胞检测

下一步，运行双细胞检测算法。识别双细胞非常重要，因为它们可能会导致下游分析步骤中的误分类或结果扭曲。Scanpy 提供了一种名为 Scrublet 的双细胞检测方法。Scrublet 通过最近邻分类器，结合观察到的转录组和模拟双细胞来预测细胞双细胞。scanpy.pp.scrublet() 函数会在 .obs 中添加 doublet_score（双细胞分数）和 predicted_doublet（预测的双细胞标记）。可以直接根据 predicted_doublet 进行过滤，也可以在后续的聚类分析中使用 doublet_score 来过滤掉那些双细胞分数较高的聚类。

sc.pp.scrublet(adata, batch_key="sample")

有两种方式可以移除双细胞：

• 一种是在早期直接过滤掉被标记为双细胞的细胞；
• 另一种是在完成聚类后，再移除那些双细胞分数较高的聚类。

Reference

[1]

Source: https://scvelo.readthedocs.io/en/stable/about.html