张锋团队：一种新型可编辑的蛋白质递送系统

和大家分享一篇张锋团队最近发表在Nature上的研究“Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system”，一种可编辑的蛋白质递送系统，有望将任何蛋白精准地递送到目标细胞，与CRISPR/Cas9技术一样，这也是从细菌中获得启发和改造的一项技术。自然界内存在这样一些内共生菌，它们寄生在宿主体内，当宿主攻击有机体时，它会分泌一些因子杀伤有机体为宿主提供营养，与宿主互利共生；上述运输因子到有机体内的系统称作收缩注射系统（Contractile injection systems , CIS）。

发光杆菌是昆虫病原菌线虫的共生菌，体内CIS被称作PVC (Photorhabdus virulence cassette )。PVC由约20kb操纵子的编码翻译而成，上游的19.6kb 包含PVC的结构和辅助基因（pvc1-16），下游4.2kb包含编码发光杆菌的天然毒素pdp1、pnf和相关的调节基因。

研究团队通过基因工程实现了PVC的重构：构建两个质粒pPVC和pPayload分别携带pvc1-16与 payload and regulatory基因，将这两个质粒同时转化到大肠杆菌中，扩大培养后进行蛋白纯化，最后成功获得了载有天然载物的PVC混悬液。基因工程获得的PVC在结构和功能上与天然PVC一致。

若要将PVC运用于蛋白递送，要解决两个主要问题：（1）PVC如何招募天然的荷载物；（2）PVC如何靶向目的细胞。根据清华大学高宁团队的研究，荷载物的N末端信号肽序列参与招募。张锋团队构建了融合有NTD的GFP/CRE/ZFN的pPayload质粒，可成功被PVC运输到昆虫细胞发挥作用。这再次证明了高宁团队的研究成果。

关于PVC的靶向性，在结构上，PVC的尾纤维结构类似于T4噬菌体的尾纤维，且Pvc13蛋白（即尾纤维结构）具有一段与T4噬菌体尾纤维相似的结构域，通过AlphaFold预测Pvc13尾纤维的尖端结构（与靶细胞进行初接触的结构域），确定pvc13的C末端形成的球状尖端螺旋管结构域是尾纤维的结合结构域。PVC尾纤维与噬菌体尾纤维不同的是，PVC尾纤维基因pvc13还含有来自五型腺病毒的受体结合蛋白的区域，为PVC尾纤维参与真核生物体的识别提供了理论基础。

那么对Pvc13尾纤维蛋白进行修饰是否可以改变PVC的靶向性呢？研究团队构建了两个针对人类细胞特异性结构域的pPayload质粒：一个是针对五型腺病毒的三聚体结构域（Ad5），另一个是针对EGFR设计的特异性锚蛋白重复序列 （DARPin) E01，将上述两序列插入到pvc13的C末端，产生pvc13-Ad5-knob或pvc13-E01-DARPin的pPayload质粒，将获得的PVC悬液处理A549细胞（高表达EGFR并对五型腺病毒敏感），改造过的PVC可有效结合到细胞上并杀死细胞。

那么PVC是否也可以在体内发挥传递作用呢？研究团队构建了靶向小鼠细胞的PVC变体，颅内注射成功将CRE重组酶运载到小鼠颅内并发挥功能。

值得关注的是，PVC在小鼠体内未激活任何免疫细胞、未产生炎症因子，也没有细胞毒性，体内代谢快。

综上，PVC作为一个可编辑的蛋白传递系统，具有较大的发展潜力，预计将在生物医药领域得到广泛关注和应用。

参考

[1] Kreitz, J., Friedrich, M.J., Guru, A. et al. Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system. Nature 616, 357–364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

[2] Feng Jiang et al., N-terminal signal peptides facilitate the engineering of PVC complex as a potent protein delivery system.Sci. Adv.8,eabm2343(2022). DOI:10.1126/sciadv.abm2343