文献分享--空间转录组学揭示致命性COVID-19肺部的原位细胞和分子标志

作者，Evil Genius

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核心问题：严重COVID-19可诱导进行性弥漫性肺泡损伤（DAD）导致致命后果，但肺部损伤的分子背景尚未完全建立。

摘要

严重COVID-19可诱导进行性弥漫性肺泡损伤（DAD）导致致命后果。本研究利用Visium空间转录组学对COVID-19和对照肺样本进行分析，以揭示驱动致命性COVID-19的细胞和分子事件。

• 内皮细胞类型、I型肺细胞和自然杀伤（NK）细胞的进行性丢失，伴随髓系和基质细胞（主要是支气管周围成纤维细胞）的持续增加，跨越急性和增殖性DAD。
• 空间组织分析还识别出特定区室化，包括跨DAD模式的免疫特异性聚类。
• 重要的是，空间信息配体-受体相互作用分析揭示了定义COVID-19诱导DAD的细胞间通讯特征。
• 转录因子活性富集分析识别出TGF-β通路作为DAD驱动因素，突出SMAD3和SMAD7活性在纤维化期间的拮抗作用。
• 整合这些数据得出支气管周围成纤维细胞中的信号激酶通路，具有可用的新靶点。
• 最后，时空轨迹分析表征了肺泡上皮再生程序。

引言

1. COVID-19的疾病负担

• SARS-CoV-2病毒感染引起全球COVID-19大流行。已报告超过7.75亿确诊病例和超过700万死亡。
• 尽管大多数受影响个体表现轻微临床症状或无症状，但与肺损伤和急性呼吸窘迫综合征相关的呼吸衰竭可能发生，是最常见的死亡原因。
• 重要的是，部分COVID-19患者肺部病变的维持也可能与 prolonged 临床表现相关。

2. 严重COVID-19的病理变化

• 严重病例中SARS-CoV-2感染后，病理变化定义为弥漫性肺泡损伤（DAD），始于急性期的早期肺泡内上皮病变、间质炎症和水肿，随后是增殖期，最终出现肺细胞增生和成纤维细胞增殖。

3. 现有研究局限

• SARS-CoV-2感染引起的肺损伤的分子背景尚未完全建立。
• 大多数研究涉及bulk转录景观或特定谱系如免疫细胞。
• 单细胞基因表达谱提供了更细粒度的视图，但这些方法破坏了肺的解剖结构和空间细胞-细胞相互作用。
• 只有有限数量的研究分析了COVID-19病例肺部的空间成分，使用高参数成像质谱流式细胞术靶向蛋白质或聚焦于感兴趣区域（ROI）。
• 重要的是，COVID-19患者中空间转录组学的更大规模病理学审查仅在最近才进行。

4. 本研究目标

• 利用最近开发的Visium空间转录组学（VisiumST）技术，在正常组织学和致命性COVID-19病程中发生DAD的肺队列中进行分析。
• 使用人类肺细胞图谱的单细胞RNA表达数据注释细胞类型，提供45种细胞类型的转变、细胞间通讯扰动和严重COVID-19时分子通路空间改变的全貌。

结果

结果1、COVID-19相关DAD组织学模式中肺细胞类型和细胞区室的识别

研究设计与样本：

• 获取23个FFPE尸检肺组织样本，来自19例DAD患者：7例急性DAD，12例增殖性DAD；以及4例形态正常、无SARS-CoV-2感染的对照肺样本。
• 使用微阵列载玻片上的组织spot分析空间转录组模式，捕获空间基因表达信息。
• 质量控制（QC）和预处理后，共研究91,068个组织spot。

细胞类型注释与反卷积：

• 使用整合的人类肺细胞图谱（HLCA）作为参考，应用验证的cell2location pipeline反卷积每个spot中存在的主要细胞类型。
• UMAP使用整合的全局空间转录组数据显示三个肺样本组（对照、急性DAD、增殖性DAD）区分开来。
• 使用cell2location在肺样本中注释了45种HLCA定义的细胞类型。
• 按谱系（上皮、基质、免疫和内皮）的UMAP可视化显示，来自不同供体的spots在每个DAD模式内良好混合，表明整合数据集中供体驱动的批次效应有限。
• 识别的细胞类型映射到VisiumST H&E染色明场图像上，细胞类型映射到预期位置，与良好描述的结构匹配：上皮细胞排列在气道腔，基质细胞映射到血管壁，由内皮（CD34）和上皮（CK7）标志物免疫染色验证。

主要发现：

• 对照肺中最丰富的谱系对应于内皮细胞类型。
• 急性DAD的特征是内皮细胞比例相对减少（尽管内皮细胞仍是主要谱系），伴随免疫和基质细胞比例增加。
• 增殖性DAD主要由大量纤维化组织定义。
• 尽管跨组织学模式观察到变化，但只有增殖性DAD中内皮细胞减少相比对照显示显著可信的转变（FDR<0.05）。

细胞类型特异性变化：

• 内皮谱系：增殖性DAD中，内皮细胞（EC aerocyte capillary、arterial、general capillary和venous pulmonary）丰度显著减少，支持SARS-CoV-2感染与内皮功能障碍相关的证据。
• 免疫谱系（19个识别的细胞群体）：
  • 髓系谱系：肺泡巨噬细胞（Mph）、CCL3+和单核细胞衍生Mph在COVID-19相关增殖性DAD病例中显著过表达，相比对照和急性DAD肺。间质Mph血管周显示进行性增加。
  • 淋巴谱系：增殖性COVID-19患者中CD4和CD8 T细胞减少，相比对照。
  • NK细胞：从对照和急性DAD样本到增殖性DAD病例显著减少。这些先天效应淋巴细胞响应急性病毒感染，先前与COVID-19严重程度相关。
  • 肺泡巨噬细胞和浆细胞在增殖性DAD肺中过表达，相比对照。
• 基质谱系（9种细胞类型）：
  • 最显著的变化是支气管周围成纤维细胞（PBFs），从对照到急性DAD增加，在增殖性DAD病例中激增。
  • 并非所有成纤维细胞亚型行为相似。胸膜下成纤维细胞在COVID-19相关DAD致命病例中过表达，相比对照，且在急性和增殖性DAD之间；而肺泡成纤维细胞和血管周细胞在增殖性DAD样本中减少，相比对照和急性DAD肺。最后，外膜成纤维细胞在增殖性DAD样本中过表达，相比对照。

空间区室分析：

• 应用cell2location算法到VisiumST数据，评估45种识别细胞类型在邻近区室中的空间分布。
• 对细胞类型丰度估计进行非负矩阵分解（NMF），识别8个 distinct NMF组件（因子），捕获跨组织的 underlying 细胞邻域结构，称为空间区室。
• 正常肺：表征的细胞类型映射在生理细胞微环境内，如由免疫和内皮细胞定义的大区室，一个富含上皮细胞的区室（排除AT2增殖、subp-basal和deuterosomal细胞，它们共享共同位置），另一个与平滑肌相关细胞和成纤维细胞谱系相关（PBFs位于隔离区室）。
• 急性DAD：特征是富集AT2增殖群体募集到上皮区室；巨噬细胞亚型和2型树突状细胞（DC2s）空间聚类的突入；浆细胞在隔离群体中出现。
• 增殖性DAD：大多数这些细胞重新分布进一步区室化，额外出现淋巴成熟内皮细胞的独特区室。

GraphCompass分析：

• 应用GraphCompass定量确定和比较不同生物条件下 distinct 细胞类型的空间排列。
• 细胞类型特异性子图跨条件对显示：PBFs、肺泡成纤维细胞、AT2细胞、EC aerocyte capillary细胞和单核细胞衍生Mph表现出高方差空间相似性评分，表明其空间结构显著重塑，尤其是在增殖性DAD期间。
• 使用过滤曲线评估含有每种细胞类型的空间连接spots如何基于增加的距离阈值连接。右移曲线表示更紧密的空间聚类，左移曲线表示更分散的分布。
• 在增殖性DAD中，PBFs和AT2细胞表现出更强的空间聚类，而毛细血管内皮细胞显示更碎片化、分散的模式，与其在急性和增殖性DAD中的耗竭一致。
• 这些分析强化了这些细胞类型在丰度上经历反平行转变的发现：PBFs和AT2细胞过表达，而内皮aerocyte capillary细胞耗竭，特别是在增殖性DAD。

结果2、COVID-19相关DAD中的空间细胞-细胞相互作用

细胞间通讯（CCC）分析：

• 使用VisiumST数据识别跨所有组织载玻片共享的协调细胞-细胞通讯特征，通过应用NMF到估计的局部（spot水平）配体-受体相互作用（LRIs），使用空间加权Cosine相似性与LIANA计算。
• 使用肘部选择程序，将局部相互作用分解为三个因子（1、2和3），代表三种不同的细胞间通讯特征。
• NMF因子评分表示每个spot中每个因子的强度，代表相关特征的影响程度。
• 每个组织载玻片的平均因子评分根据肺状态聚类。
• Factor 3最好地区分对照和COVID-19相关DAD肺组织，在增殖性DAD中平均评分高。Factor 1在对照样本中最突出，而Factor 2在增殖性DAD子集中更活跃。

LRI通路富集分析：

• 使用多元线性回归和PROGENy通路注释对贡献于三个因子的 distinct 相互作用负载进行LRI通路富集分析。
• DAD相关Factor 3在转化生长因子β（TGF-β）通路相关相互作用中显著富集，TGF-β是参与组织损伤反应的纤维化驱动因素。相反，DAD相关Factor 3在EGFR通路中耗竭。
• WNT通路在Factor 1（对照样本特征）中富集，但在Factor 2中耗竭。

Factor 3的Top LR负载：

• TIMP1-CD63：通过TGF-β1/SMAD3通路促进肺纤维化。
• APP-CD74：突出APP（淀粉样β前体蛋白）在感染期间作为肺毛细血管屏障防御的作用。
• CD99-CD81：T细胞和B细胞活性的调节因子。
• LUM-ITGB1：LUM与ECM重塑和炎症相关成纤维细胞相关。
• 其他值得注意的LRIs涉及PSAP（PSAP-LRP1）和S100蛋白家族成员S100A8（S100A8-AGER、S100A8-ITGB2）和S100A9（S100A9-AGER、S100A9-CD68、S100A9-ITGB2），已报道在COVID-19中激活巨噬细胞；SPARC蛋白（SPARC-ENG），TGF-β的下游效应物，在COVID-19相关纤维化和IPF中上调；以及波形蛋白（VIM-CD44），SARS-CoV-2进入内皮细胞的附着因子。
• 涉及的三个最频繁受体：CD44（参与T细胞丰度和促进与COVID-19不良预后相关的细胞因子风暴）、ITGB1（与ACE2关联介导SARS-CoV-2进入并调节ECM重塑）、LRP1（参与细胞因子和趋化因子过度产生，在致命和长COVID-19患者中富集）。

转录因子（TF）活性分析：

• 基于多元线性回归使用decoupler和CollecTRI网络估计每个VisiumST spot中的TF活性。
• 数据突出TGF-β通路在急性和增殖性DAD中的关键作用，与细胞间LRI分析一致。
• 值得注意的是SMAD蛋白家族成员的相反活性景观：增殖性DAD以SMAD3上调为特征，SMAD3是TGF-β信号的关键介质，促进ECM产生、组织修复、纤维化和瘢痕形成。相反，SMAD7活性（对TGF-β/SMAD3促纤维化通路起拮抗作用）在DAD组织学模式中下调。
• 使用可解释多视图方法建模Factor 3评分，使用每种条件下富集的top 10 TF活性评分。该TF-only模型解释了所有增殖性DAD样本中Factor 3评分的中位数50%方差，支持TF活性对Factor 3捕获的空间模式的贡献，特别是在增殖性DAD中。相反，对照和急性DAD样本中解释的方差较低，强调Factor 3在增殖性DAD中的相关性。
• 在该TF-only模型中，SMAD3在Factor 3评分的top 6正预测因子中排名，而SMAD7显示较低的预测重要性。预测因子重要性显示COVID-19 DAD样本中SMAD3贡献较高，SMAD7贡献较低，相比对照。

扩展HLCA数据集验证：

• 分析扩展HLCA数据集跨越COVID-19、非COVID-19肺炎、IPF、COPD和健康肺，包含来自434个样本和298个供体的1,401,006个细胞。
• 广泛重现了Visium ST发现。COVID-19-DAD相关TFs如SMAD3、ZEB2和CIITA在COVID-19中上调（FDR<0.001）。
• SMAD3/SMAD7轴显示强COVID-19疾病特异性，SMAD3和SMAD7分别在COVID-19相比健康肺中排名第2上调和下调TFs，这种模式在非COVID-19肺炎、IPF或COPD中未观察到。特别是，SMAD3在非COVID-19肺炎中下调，而SMAD7在IPF和COPD中上调。
• NKX2-1在COVID-19中下调，而在非COVID-19肺炎、IPF和COPD中上调，与这些其他肺病理学参与NKX2-1驱动的AT2再生作为晚期修复反应一致。

其他重要发现：

• TGF-β信号通路的改变进一步得到两个额外组分的加强：TGFβIII（收缩性平滑肌细胞标志物）和ZEB2（参与纤维化），分别在对照和增殖性DAD肺中上调。有趣的是，ZEB2 DNA甲基化状态与SARS-CoV-2感染的另一个严重后果——儿童多系统炎症综合征相关。
• 两个额外的细胞网络受到异常TF活性靶向：肺上皮细胞分化和NK细胞功能。在第一种情况下，AT2细胞身份调节因子ETV5在COVID-19诱导DAD后下调，表明AT2细胞启动上皮再生，而NKX2-1（肺泡上皮祖细胞调节因子）在增殖性DAD中上调。值得注意的是，SREBF2（与AT2细胞表面活性物质产生相关）和CIITA（驱动MHCI表达并诱导细胞对SARS-CoV-2抗性）在急性DAD肺中富集。
• 对于NK细胞，观察到跨急性和增殖性COVID-19-DAD减少，IKZF1（NK细胞正常发育必需的TF）在DAD肺中也下调，支持COVID-19中NK细胞功能障碍可能与致死性相关。

结果3、配体-受体相互作用和转录因子活性与细胞类型丰度的空间关系

可解释多视图建模：

• 使用可解释多视图建模方法破译LRIs、TFs和 distinct 细胞类型丰度之间的全局空间关系。
• 联合建模每个空间spot中的细胞类型丰度，使用来自Factor 3的top 25局部LR负载和每种条件下top 10最富集TFs的活性。
• 在对照和DAD肺组织载玻片中，LRIs和TFs活性联合贡献解释细胞类型丰度的方差（平均多视图R²=0.21）。对联合预测性能的相对贡献，TF活性更高（中位数贡献65%），相比LRIs（中位数贡献35%），跨急性和增殖性DAD。
• 重要的是，成纤维细胞的丰度最好由TFs SMAD3和SMAD7的活性解释，包括TIMP1-CD63 LRI在PBFs的top 10预测因子中，突出其对DAD的贡献。
• 此外，在解释对照肺和COVID-19诱导DAD的细胞组成时也发现重要差异，特别是对于PBFs、内皮aerocyte capillary细胞、内皮general capillary细胞、肺泡Mph亚型、单核细胞衍生Mph、非经典单核细胞和NK细胞。

细胞内信号网络推断：

• 使用预测因子重要性（系数t值）从预测线性模型推断连接LRIs和TF活性模式的细胞内信号网络。
• 应用LIANA+推断连接LRIs到TFs的推定因果网络，聚焦PBFs，考虑其在增殖性DAD肺和IPF患者中的显著富集。
• 发现ITGB1受体的初始激活释放下游信号通路，上调转录因子SMAD3、MYB和BRCA1，下调SMAD7和CIITA。
• 重要的是，ITGB1介导的CIITA抑制可以在损伤后激活肺成纤维细胞的胶原表达。
• 有趣的是，还发现整合素ITGB1诱导激酶ILK、AKT1、MAP2K4和MAPK14的激活，先前与该疾病相关，成为可行的治疗候选者。

局部空间依赖性分析：

• 利用空间信息局部双变量相似性度量（包括空间加权Cosine相似性和全局Moran's R）识别空间聚类在一起或分开的LRIs对。
• TIMP1-CD63在两种度量中显示最高的空间共聚类模式，特别是在增殖性DAD肺中，在DAD相关Factor 3边界内。
• 计算的基于置换的p值评估局部相互作用的显著性，显示与高Cosine相似性区域一致。
• 进一步分类TIMP1-CD63空间关系，识别出对于大多数局部类别区域，配体和受体均高表达。
• 有趣的是，APP参与多个LRIs，包括APP-CD74（第二高Cosine相似性）。另一个APP LRI，APP-AGER，在急性和增殖性DAD中显示明显的递减空间共聚类模式，表明生物学关系，因为AGER是AT1标志物，在本研究中也被观察到。
• 最后，多个LRIs与参与COVID-19中Mph激活的蛋白质，如S100A9，通过DAD模式显示增加的空间共聚类。有趣的是，S100A9-CD68，所有Mph亚型、非经典单核细胞和T细胞增殖细胞类型丰度的最佳LRI预测因子，产生最高的中位数全局Moran's R评分之一，表明在异常髓系激活和失调免疫反应中的重要角色。

细胞类型与TFs活性关联：

• 研究细胞类型与TFs活性之间的关联，使用空间加权Cosine相似性和全局Moran's R。
• PBFs，增殖性COVID-19中最丰富的细胞类型，与促纤维化TF SMAD3活性位置最空间相关和共聚类，而PBFs和抗纤维化TF SMAD7活性位置空间聚类分开。
• 这些结果符合SMAD3和SMAD7活性通过DAD模式的互斥位置；以及top LRI负载TIMP1-CD63表征DAD相关Factor 3，通过TGF-β1/SMAD3通路促进肺纤维化。
• 所有这些结果突出TGF-β通路激活在驱动病理性ECM重塑和修复中的中心作用，与PBFs异常激活相关，导致瘢痕形成和COVID-19增殖性DAD中严重破坏的肺组织结构。

髓系谱系示例：

• TF MYB活性是髓系细胞类型丰度的最佳预测因子。MYB与髓系和T细胞增殖细胞命运的空间共表达在急性和增殖性DAD中增加。
• MYB在许多造血通路中发挥重要作用，最重要的是，髓系细胞群体的E2F/MYB调节程序在严重COVID-19病例中过度激活。
• 免疫景观的询问还揭示NK细胞，另一个在COVID-19相关DAD中严重耗竭的群体，最受IKZF1活性影响，显示最高的共聚类模式。IKZF1对正常NK细胞发育至关重要。报告了IKZF1和NKs在COVID-19相关DAD模式中的共聚类模式丢失。这些结果加强了NK细胞功能障碍在致命COVID-19中的建议中心作用。

肺上皮分化：

• 聚焦肺上皮分化，NKX2-1活性是AT2细胞丰度的最佳预测因子，并显示与这一关键细胞群体在肺泡再生中空间关联最强。NKX2-1是肺泡上皮祖细胞的良好建立调节因子。
• 值得注意的是，NKX2-1活性和AT2细胞之间的空间共定位在增殖性DAD病例中增加。这一空间模式支持正在进行的肺泡再生在增殖性DAD中占优势的概念。
• 总之，这些发现加强了表征TF活性和细胞类型跨COVID-19诱导DAD模式的空间分布和共定位的更广泛相关性。

结果4、作为生态位组成函数的细胞-细胞通讯

NCEM分析：

• 使用图神经网络方法（NCEM）评估细胞间通讯事件，估计跨spots中细胞类型内基因表达变异的影响。
• 区分对照和致命COVID-19肺组织之间差异细胞间依赖性，识别跨DAD模式的多个细胞类型。
• 观察到对照肺中NK细胞对各种细胞类型的依赖性，包括CD8 T细胞、EC aerocyte capillary细胞、肺泡Mph CCL3+和AT1细胞。然而，这些依赖性在急性和增殖性COVID-19肺组织中丢失。
• 还发现在DAD样本中，CD4 T细胞群体对多种细胞类型表现出依赖性，如非经典单核细胞、SM激活应激反应细胞、浆细胞和AT1细胞，成为增殖性受体节点，特别是在急性DAD中。
• 有趣的是，AT1细胞在对照肺样本中表现出有限的细胞间依赖性，在急性DAD中增加，在增殖性DAD中丢失。最后，CD4 T细胞建立了对AT2细胞的依赖性，在增殖性DAD中。
• 此外，进行受体效应分析，突出基因-wise效应对所有发送者对一个接收者细胞类型，以情境化基因表达差异在一些耦合中。此外，由于CD4 T细胞在DAD肺中显示对多个细胞类型的重要依赖性，进行发送者相似性分析以表征CD4 T细胞接收者的依赖性 profile 跨DAD模式。
• 热图表示成对发送者效应向量的相关性，捕获相似发送者细胞类型在其对CD4 T细胞的调节影响中。观察到在急性DAD肺中，发送者 profile 最一致地保留谱系细胞类型身份，但在增殖性DAD肺中丢失。

时空轨迹：

• AT2细胞在肺损伤期间作为AT1祖细胞发挥重要作用，增殖并促进肺泡修复和再生。相反，AT1细胞易碎，易受损伤，无法增殖。
• 因此，表征AT2-AT1分化对于提供对严重COVID-19中细胞过程和组织修复机制的新见解很重要。
• 使用stLearn软件中实现的基于空间图的方法伪时间-空间（PSTS）破译跨空间和时间的动态关系。
• 通过结合空间和成像信息，代表细胞和组织形态学，与基因表达数据，使用PSTS图谱映射AT2和AT1细胞状态的空间变化，建模和重建其时空轨迹。
• 定义AT2细胞转分化为AT1细胞的轨迹跨两个聚类（clade 6和clade 9）在增殖性DAD肺中。这些clade代表通过PSTS推断的转录相关spots的 distinct 空间聚类。
• top 10上调和下调基因定义AT2到AT1转变在每个clade中显示。富集分析显示，clade 6中top 10上调基因富集AT1细胞身份标志物，包括ICAM1、DSP、ANGPTL2和AGER。同样，clade 6中top 10下调基因富集AT2细胞身份标志物，包括SFTPB、SCD和CYB5A。此外，clade 9中top 10下调基因也富集AT2细胞身份标志物，包括SFTPB、SFTPC、SLC34A2、FASN、CTSH、DBI、MLPH、LPCAT1和CYB5A。这些结果进一步验证了AT2和AT1细胞状态中的推断时空轨迹，更好地表征肺泡上皮再生过程 after 肺损伤。
• 有趣的是，clade 6和clade 9之间的比较揭示，CAV1，一种晚期AT1成熟标志物，在clade 9中上调但在clade 6中不上调。这表明clade 9与更完整的AT2到AT1细胞转变相关，而clade 6可能代表中间状态的分化。
• 这进一步得到细胞类型特异性基因表达CAV1在肺细胞亚型中空间坐标的支持，其中CAV1仅在AT1细胞中表达但在 distinct 位置，而共定位AT2和衍生AT0细胞在肺泡修复期间，驱动大多数CAV1总表达跨所有细胞类型。
• 总之，尽管需要进一步的实验生物学验证，这些结果支持肺中严重COVID-19患者的AT2细胞在激活肺泡上皮再生程序后重新填充AT1细胞的观念。

结果5、与 非COVID-19 DAD和特发性肺纤维化的空间转录组学比较

非COVID-19 DAD分析：

• 为了将观察到的细胞和空间特征归因于COVID-19特异性病理生理变化而非ARDS和DAD的一般特征，将观察结果与非COVID-19 DAD病例和特发性肺纤维化样本进行比较。
• 对8个非COVID-19 DAD样本进行额外空间转录组学分析。重要的是，其中三个病例在COVID-19大流行前（2018年）收集，完全排除未诊断的SARS-CoV-2感染。
• 与COVID-19相比，非COVID-19 DAD样本显示内皮谱系 predominance 高于免疫。在基质区室内，肺泡成纤维细胞 predominance，与COVID-19增殖性DAD中PBFs的显著扩张形成对比。肺泡成纤维细胞与组织稳态和纤维化调节相关，表明其在非COVID-19 DAD中的 predominance 反映了与COVID-19 DAD中PBFs驱动的纤维化重塑不同的修复反应。
• 此外，发现非COVID-19 DAD病例缺乏在COVID-19 DAD中观察到的广泛激活的髓系亚型和巨噬细胞群体，而是显示特定免疫细胞类型的 predominance，如经典单核细胞。与COVID-19 DAD不同，PBFs形成 distinct 空间生态位，非COVID-19 DAD样本中的PBFs未聚类成 discrete 生态位，而是与其他基质、内皮和免疫细胞类型共定位。

IPF分析：

• 进一步基准测试COVID-19病例 against 非COVID-19起源的纤维化肺损伤，处理和重新分析公开可用的IPF样本Visium空间转录组数据。该数据集包括4例IPF患者的肺样本，每例有三个组织块代表增加的纤维化损伤水平，以及4例无已知肺病个体的对照样本。
• 使用应用于COVID-19数据集的相同细胞类型反卷积和空间共定位计算管道，发现IPF样本表现出更大的上皮和免疫谱系 predominance 和减少的内皮细胞代表性，相比COVID-19样本。
• 此外，低纤维化IPF区域由AT2细胞主导，与COVID-19 DAD中AT2细胞不那么突出形成对比。
• 最后，与COVID-19-DAD中PBFs形成独特空间细胞区室不同，IPF样本中的PBFs未组织成个体生态位。相反，跨纤维化程度增加的区域，PBFs倾向于与其他基质和免疫细胞类型共定位，特别是在高度纤维化区域，表明PBFs在IPF中空间细胞区室化中的作用与COVID-19-DAD不同。

总体结论：

• 跨非COVID-19 DAD和IPF样本的扩展分析强化了识别的细胞和空间标志不仅仅是纤维化损伤或非特异性DAD的反映，而是更 characteristic of COVID-19诱导的DAD。

讨论

主要贡献

• COVID-19中丰富的转录组信息主要来自解聚的肺组织，器官结构未保留，因此周围组织微环境对基因表达的影响丢失。
• 这个问题最近才在COVID-19影响的肺组织中研究，但主要针对靶向标志物或离散位置。
• 以类似方式，VisiumST已在IPF中空间解析转录组。作者的空间转录组分析，使用最新开发的生物信息学工具，提供了致命COVID-19肺的景观，定义为特定细胞群体的深刻转变，伴随扭曲的细胞间通讯，最终破坏重要基因网络。

细胞类型组成变化

• 在观察到的细胞类型组成变化中，PBFs显示最显著的增加，特别是在增殖性DAD中。大多数其他成纤维细胞亚型也在急性和增殖性COVID-19-DAD中增加。
• 相反，肺泡成纤维细胞（ contribute 组织稳态和调节肺纤维化）减少，连同功能呼吸肺泡的关键细胞类型，包括AT1上皮细胞和aerocyte capillary内皮细胞。
• 相反，在非COVID-19 DAD病例中，肺泡成纤维细胞在基质区室中保持 predominance，突出与COVID-19 DAD中PBFs驱动的促纤维化重塑不同的修复反应。
• 有趣的是，增殖性DAD显示各种亚型肺泡Mph增加。此外，髓系谱系整体增加，包括间质和单核细胞衍生Mph和非经典单核细胞，而淋巴谱系跨DAD模式减少，主要由增殖性DAD肺中NK细胞丢失驱动。
• 这些结果与报道的致命COVID-19中髓系细胞异常激活和T细胞和NK细胞反应受损一致。在这方面，强调NK细胞在严重COVID-19中的重要作用，表征NK细胞功能障碍，伴随其功能发育和成熟必需TFs活性的显著下调，特别是IKZF1。报告了NK细胞跨DAD模式的进行性和持续性功能障碍，进一步暗示其损伤在致命COVID-19中。
• 除了NK细胞功能障碍，对SARS-CoV-2感染的失调免疫修复反应已被提议为疾病进展的主要贡献者。因此，描述了与免疫系统基本元素相关的LRIs和TFs活性，识别S100A9-CD68 LRI和MYB TF活性作为髓系细胞类型丰度的主要决定因素，显示跨急性和增殖性DAD增加的空间共表达模式，加强其在严重COVID-19中Mph激活中的作用。

分子驱动因素

• 表征了导致大规模纤维化和严重破坏组织结构的肺损伤病理反应的分子驱动因素。
• 报告TGF-β通路在DAD组织学模式中的关键作用，识别促纤维化SMAD3上调 coupled with 其拮抗剂SMAD7下调。
• 重要的是，识别TIMP1-CD63 LRI作为DAD的主要贡献者，强调TIMP1作为ECM稳态关键调节因子和TGF-β通路激活下游效应物的作用，成为肺纤维化的候选治疗靶点。
• 此外，推断PBFs中的细胞内信号网络，表明表型变化和SMAD TFs的不同靶向涉及整合素ITGB1受体及其相关下游激酶AKT1、MAP2K4和MAPK14的激活，代表COVID-19治疗的额外潜在靶点。

细胞间依赖性

• 分析作为生态位组成函数的细胞间依赖性时，描述了对照肺中NK细胞对各种细胞类型的依赖性，在DAD肺中丢失，而CD4 T细胞在对照肺中对多种细胞类型（包括CD8 T细胞）的依赖性在DAD中转向其他淋巴和髓系免疫细胞和基质细胞，如非经典单核细胞、浆细胞和平滑肌激活应激反应细胞类型，包括急性DAD中的上皮AT1细胞和增殖性DAD中的AT2细胞，进一步反映跨DAD模式的破坏组织架构。

时空轨迹

• 时空轨迹分析有助于表征肺泡上皮再生过程，突出AT2细胞作为AT1祖细胞的重要作用，并识别AT2到AT1分化的标志物。
• 值得注意的是，AT2到AT1分化轨迹的时空重建揭示上皮修复的区域特异性变异，表明局部组织背景可能影响肺泡再生的效率和完整性。这一过程在严重COVID-19诱导DAD病例中受损，导致这些患者的致命后果。
• 在这方面，很容易推测长COVID-19可能与细胞间通讯事件和分化轨迹的部分或完全破坏有关，无法完全恢复功能性肺泡气体交换能力和/或防止纤维化瘢痕的持续。

治疗意义

• 除了COVID-19疫苗和严重免疫缺陷个体的暴露前预防 with pemivibart，FDA已授权或批准nirmatrelvir with ritonavir（Paxlovid）、remdesivir（Veklury）和molnupiravir（Lagevrio）作为抗病毒药物，用于治疗轻度至中度COVID-19。
• 在这一治疗背景下，研究结果还可以提供和促进针对严重COVID-19空间后果特征的一些细胞类型、通路和细胞间通讯的小分子药物和抗体的研究。
• 一个例子可能与 combat 与DAD模式相关的纤维化有关。Pirfenidone和nintedanib是两种获批用于治疗IPF的抗纤维化药物，可以重新利用以避免严重COVID-19相关纤维化，因为pirfenidone抑制TGF-β（本研究中 underpinned 的主要促纤维化通路），而nintedanib阻断多种酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶，其中包括在PBFs细胞内通路分析中识别的MAPKs和AKT1。
• 在这方面，本文识别的PBFs细胞内信号通路中导致SMAD3激活的MAPK14激酶激活，表明使用MAPK14抑制剂如ralimetinib和ARRY-797，两者均表现出SARS-CoV-2抗病毒活性。
• 有趣的是，几种整合素αvβ6抑制剂，如GSK3335103和BG00011，也处于不同水平的临床前研究甚至临床试验中，用于治疗IPF。作者发现整合素ITGB1激活在致命COVID-19病例中释放PBFs中的促纤维化信号，表明该受体也可以是另一个可行的靶点。
• 类似的情况可以用于观察到的新兴和过度激活的炎症髓系细胞群体。在这方面，Mph和单核细胞在COVID-19中参与NOD样受体家族pyrin域 containing 3（NLRP3）炎症小体。因此，NLRP3抑制剂，如NTO793/NTO249或MCC950，可以是限制这些好战髓系细胞活性的其他有用药物。
• 重要的是，由于作者对TFs活性的整合空间转录组分析产生MYB作为严重COVID-19中Mph的主要决定因素，它可以被提议作为候选药物靶点。类似地，报告S100A9-CD68 LRI作为髓系细胞类型的主要决定因素。有趣的是，S100蛋白家族成员S100A8和S100A9已被研究作为小分子如paquinimod的潜在靶点，以控制COVID-19中的异常髓系激活。

其他治疗思考

• 与治疗相关，还可以简要提及一个 provocative 的想法。由于多个LRIs涉及APP（如APP-CD74）；COVID-19后认知缺陷可能是由于肺病变释放到血液中的β-淀粉样蛋白；且SARS-CoV-2感染是阿尔茨海默病的风险因素，作者建议也许可以靶向这两个过程：肺损伤和相关的认知障碍。例如，溶血磷脂酸受体（LPAR）来自G蛋白偶联受体家族， contribute 阿尔茨海默病，但也结合病毒刺突蛋白；因此，LPAR抑制剂正在研究这种潜在的双重效果。
• 关于作者研究中识别的候选靶点药物的可及性信息可在美国国家医学图书馆的http://ClinicalTrials.gov页面找到。
• 重要的是，在考虑对观察到的通路进行治疗干预时必须谨慎，因为研究的样本是尸检样本，一些发现可能反映对损伤的长期下游反应。同样重要的是要注意，假设的进展基于DAD的经典理解，因为来自同一患者的纵向样本（确认时间演化所必需的）不可用。

局限性

• 研究的一个局限性是完整的回顾性临床注释并非在所有尸检衍生队列中统一可用，且COVID-19病例代表致命疾病患者，临床复杂性高于非COVID-19对照。这限制了完全 disentangle SARS-CoV-2特异性效应与 prolonged 临床病程、共病条件或继发性肺部感染相关效应的能力。
• 尽管非COVID-19 DAD队列为与活动性SARS-CoV-2感染无关的DAD提供了更广泛的比较物，但所有样本的协调组织病理学分层受到这些存档标本回顾性质的限制。这些局限性应考虑，尽管部分被非COVID-19 DAD、IPF和HLCA验证分析所缓解。

总体结论

• 提供了致命COVID-19肺组织架构的细胞和分子标志的空间信息表征。
• 这项详细的空间转录组学研究在原位突出疾病相关的细胞亚群组成变化、其空间依赖性和破坏的细胞间通讯程序，也构成新兴空间技术潜在转化使用的概念验证。
• 这种转变需要仔细的基准比较研究，在竞争的空间转录组平台之间，协调数据处理管道和设计用户友好的数据库，其中数据可以存储和查询，自动化的样本处理和数据分析工作流程导致更短的时间框架来交付结果，连同正在进行的测序成本降低，以及可扩展的计算方法来利用空间转录组数据。
• 与最后一点相关，空间转录组学可以构成人工智能在病理学和现代医学中应用的入口点之一。在这方面，作者对致命COVID-19肺 altered 细胞和分子架构的研究可以作为空间转录组学多功能性的优秀例子，以实现新基因组技术如何改善我们对许多人类疾病的理解和个性化管理的承诺。

方法

计算分析

Visium空间基因表达文库映射：

• 使用10x Genomics的Space Ranger版本2.0.0的spaceranger count pipeline分析FFPE组织样本的Visium Spatial Gene Expression文库。
• 首先，使用Loupe Browser版本6.0在明场图像上对每个单文库FFPE样本进行手动基准对齐和组织边界识别，包括手动选择覆盖组织区域的spots。
• 从10x Genomics下载与FFPE工作流程兼容的探针集参考文件和人类参考基因组GRCh38，用于映射Visium基因表达文库。

Visium ST数据预处理：

• 执行质量控制（QC）步骤，包括过滤低质量spots，定义为检测基因数低和计数低（文库大小）。
• 使用scampy计算这些指标。作为QC自动过滤阈值，使用中位数绝对偏差（MAD）识别异常值，定义为每个组织载玻片检测基因数和文库大小的5 MADs差异。
• 线粒体含量异常值过滤器（3 MADs，包括超过8%的线粒体计数）也配置用于与标准QC工作流程的方法学一致性。然而，由于Visium FFPE Human Transcriptome Probe Set v1.0不包括线粒体编码转录本在探针面板中，线粒体计数在此数据集中结构上为零，此过滤器未移除任何spots。
• 接下来，通过缩放计数对原始计数应用归一化，然后进行移位对数变换以稳定细胞间基因表达的方差。
• 为过滤 mostly 零计数的不 informative 基因，使用deviance进行特征选择，选择top 6000高偏差基因， inspired by HLCA使用的预处理工作流程。
• 最后，使用主成分分析（PCA）、t-分布式随机邻域嵌入（t-SNE）和UMAP与scanty默认参数进行降维，以降低数据复杂性和可视化目的。
• 为识别细胞结构，通过将Leiden算法应用于先前计算的邻域图与scanty聚类细胞。
• 最后，使用andata concat()函数将单个样本对象连接成单个对象。连接后，使用全局缩放通过每个条形码的总计数重新归一化连接对象上的原始计数，并应用移位对数变换，随后使用deviance进行特征选择以选择top 6,000高偏差基因，降维和聚类如前所述。
• QC后共分析91,068个spots，包括来自致命COVID-19样本的77,580个spots和来自对照样本的13,488个spots。

人类肺细胞图谱（HLCA）参考处理：

• 利用HLCA单细胞RNA测序（scRNA-seq）参考数据集和共识细胞类型注释进行空间映射和注释。
• 下载和处理HLCA核心和数据对象，选择肺实质组织细胞类型，在最细注释级别至少150个总细胞，用于更稳健和可靠的参考模型训练，包括过滤数据集中总共333,011个细胞。
• 线粒体基因被移除用于空间映射。
• 标记基因选择对每个细胞类型进行，使用scanty工具rank_genes_groups()函数默认参数使用t-检验，并基于基因表达值计算层次聚类用于可视化，缩放表达以便更容易识别差异。

使用cell2location进行反卷积和细胞类型空间映射：

• 每个Visium spot直径55μm，包含多个潜在不同类型的细胞。为估计每个spot内这些细胞类型的丰度，使用cell2location推断细胞类型比例。
• 允许估计混合spots中低水平存在的甚至那些细胞类型的丰度，避免单个主导细胞类型掩盖其他细胞存在的问题。这种方法提供了超出二元存在-缺席分配的更细粒度细胞组成，这对于捕获跨DAD模式的细胞群体多样性至关重要。
• 连接Visium ST和过滤HLCA参考数据集都 subset 到相同的基因集作为单细胞和空间数据之间映射的基线，使用默认参数选择总共5850个Ensembl基因标识符。
• 首先，使用cell2location对HLCA scRNA-seq数据拟合参考模型，估计参考细胞类型签名，使用报告的最细细胞类型注释级别。Cell2location使用负二项回归模型估计签名，同时考虑批次效应和协变量。因此，将HLCA核心对象中的以下变量作为协变量纳入模型："assay"、"donor id"、"tissue sampling method"和"tissue dissociation protocol"。
• 为训练回归模型，使用默认参数对数据集中所有细胞进行训练。最大250个epochs足以实现收敛。
• 对于后续空间映射，cell2location需要两个用户提供的基于组织和实验QC的超参数，包括每个spot的预期细胞数，设置为20，以及RNA检测灵敏度的载玻片内或批次变异正则化参数，设置为20（默认），如先前描述的用Visium ST profiling人类肺组织。
• 模型使用完整数据训练直到收敛，40,000次迭代，使用损失函数（ELBO）。检查重建准确性图以评估模型质量。
• 映射到空间坐标的细胞丰度使用后验分布的5%分位数导出。为便于细胞类型丰度可视化，表示每个spot中最丰富的细胞类型，包括按细胞类型谱系聚合。
• 使用估计的细胞丰度构建K-最近邻（KNN）图（局部邻域大小设置为8），并应用Leiden聚类（分辨率参数设置为0.5）联合聚类所有Visium spots，使聚类身份可直接比较。
• 使用代表位置组成相似性的KNN图构建所有VisiumST样本的联合整合UMAP表示（嵌入点之间的最小距离设置为0.3，spread值设置为1）。
• 此外，计算每个空间位置每个基因的细胞类型特异性表达，并用作NCEIM细胞-细胞通讯分析和推断支气管周围成纤维细胞中细胞内信号网络的输入。
• 最后，使用非负矩阵分解（NMF）对cell2location映射结果识别细胞类型的空间共现。NMF训练一系列因子，选择8个因子用于细胞区室识别和每种条件下可视化，表示NMF因子负载。

使用scCODA进行组成数据分析：

• 为进一步分析急性和增殖性DAD中细胞类型比例的差异，应用scCODA。
• 该方法专门设计用于组成数据，其固有地受到细胞总数或所有比例之和在条件之间恒定的约束。scCODA采用贝叶斯方法建模条件之间细胞类型的相对变化，允许识别细胞类型丰度的显著转变。
• 给定空间转录组反卷积数据的组成性质，其中一种细胞类型的增加必然意味着其他细胞类型的相对减少，这一点尤为重要。scCODA帮助校正这些相互依赖性，并识别可信区间以评估哪些细胞类型比例发生了显著变化。
• 将可信和非可信效应之间的截止值设置在假发现率<0.05水平。
• 使用估计的细胞类型丰度，包括按主要谱系和细胞类型聚合的丰度，组成数据可视化使用箱线图和堆叠条形图进行。
• 上皮细胞被手动选择为参考细胞类型，用于评估跨谱系的丰度差异转变。对于涉及45种细胞类型的更细粒度分析，使用自动参考细胞类型估计，识别迁移性树突状细胞（DCs）作为跨样本最稳定的参考类别。
• 条件之间的差异使用对照样本作为对照 vs 急性DAD和对照 vs 增殖性DAD比较的对照组，而急性DAD样本用作急性DAD vs 增殖性DAD比较的对照组。

细胞类型空间排列分析：

• 使用GraphCompass在细胞类型和样本水平比较组织架构。样本建模为细胞图，条件之间的细胞类型特异性图使用portrait方法比较，计算相似性评分反映给定细胞类型跨DAD模式空间组织的一致性。这些评分的更高方差表示该细胞类型的空间模式转变更大。
• 此外，使用过滤曲线进一步探索选定细胞类型的空间组织。这些曲线表示给定细胞类型最大连通簇随增加的空间距离阈值的生长。右移曲线表示更紧密的空间聚类，而左移曲线反映更分散的分布。
• 对于计算空间图，使用Visium ST样本的默认参数，并将簇键定义为spot-wise最丰富的细胞类型。

细胞-细胞通讯（CCC）分析：

• 为分析细胞间通讯事件，在Visium ST载玻片上使用LIANA+寻找潜在配体-受体相互作用（LRI）。
• 为评估LRIs的空间共现，使用空间信息局部（个体spot水平）双变量相似性度量，包括空间加权Cosine相似性和局部Moran's R。这些度量使用基于spots之间空间连接性的权重，定义为使用逆欧几里得距离的径向核。
• 由于评估LRIs，仅考虑配体、受体及其亚基在至少5%的spots中表达的相互作用。
• 此外，局部相互作用根据其大小和符号分类，允许识别局部类别，其中相互作用进一步分类为high-high（两个变量均高表达）或high-low（一个变量高表达，另一个低表达）。
• 此外，使用spot标签置换（N=100）生成零分布并计算经验局部p值以评估局部度量的统计显著性。
• 除了局部双变量评分和获得局部相互作用结果的"全局"摘要外，获得每对变量的全局评分，包括全局均值（平均）、Cosine相似性和全局Moran's R，以识别聚类在一起或分开的变量对，并选择最佳候选用于可视化和下游分析。
• 超越LRIs，应用相同方法评估转录因子（TFs）活性与细胞类型丰度之间的空间关系。为使分布可比，对TF活性和细胞类型丰度进行z-缩放。
• 为识别协调的细胞-细胞通讯特征，对局部LRI评分使用NMF。启发式肘部程序选择三个因子作为最优组件数。每个组织载玻片的平均NMF因子评分根据疾病状态聚类样本，并使用热图表示和层次聚类（欧几里得距离和Ward方法）可视化。
• 对LRI负载进行通路富集分析以生物学表征三个识别的因子。为此，将PROGENy资源的通路注释转换为配体-受体集，将LRIs分配给特定通路。接下来，使用多元线性回归与decoupler进行富集。对于LRI分析，使用LIANA+共识资源。

转录因子活性分析：

• 为基于先验知识推断TF活性，使用CollectRI资源，包含TFs及其转录靶点的 curated 集合，相互作用按其调节模式（激活或抑制）加权。
• 为估计TF富集评分，对每个spot和每个TF使用decoupler运行多元回归模型，拟合线性模型以基于相互作用权重预测基因表达。获得的斜率t值是评分，表示TF的激活或失活，如果为正或负。
• 每种条件下富集的TFs使用decoupler rank_sources_groups()函数与t-检验识别，该检验高估每组方差。提取每种条件下top 10 TFs，并使用缩放TF富集评分在热图中表示，缩放范围0到1，意味着对每个TF，减去最小值并除以最大值。注意给定TF可能出现在多个条件下，如果它在多个条件中排名top 10富集TFs（例如，SMAD7在对照和急性DAD中）。此外，未缩放的TF富集评分在 illustrative Visium ST载玻片上表示。

使用细胞类型丰度学习LRIs和TFs活性之间的空间关系：

• 为学习局部LRIs、TFs活性和细胞类型丰度之间的空间依赖性，使用MISTy，一种可解释的多建模方法。
• 选择来自Factor 3的top 25局部配体-受体负载和每种条件下top 10 TFs的富集评分，以空间信息方式联合建模每个spot中估计的细胞类型丰度。
• 具体使用线性模型，因为系数t值（预测因子重要性），由普通最小二乘法（OLS）计算，是有符号且可比较的。
• 重要的是，绕过预测intraview（intra-spot），对于每个目标（细胞类型），不仅评估预测因子重要性，还评估LRIs和TFs解释细胞类型丰度的程度，使用联合多视图R²（拟合优度）并评估其对联合预测性能的相对贡献。

支气管周围成纤维细胞中的细胞内信号网络：

• 从先验知识推断细胞内信号网络，通过链接识别的LRIs和TF活性评分。
• LIANA+方法考虑失调方向，包括受体和TFs的激活和抑制，以及来自蛋白质-蛋白质相互作用和TFs及其靶点先验知识的边（激活或抑制）的符号和方向，来自Omnipath。
• 使用CORNETO，推断连接LRIs到TFs的推定因果网络，针对支气管周围成纤维细胞。
• 因此，使用预测线性模型对支气管周围成纤维细胞丰度的系数t值作为细胞内信号网络的输入（LRIs）和输出（TFs）节点。
• 为此，计算跨样本的t值中位数，并按绝对中位值排序。对于LRIs，选择受体，当同一受体涉及多个LRIs时，保留该受体的最大绝对中位t值作为输入节点。
• 此外，获得来自Omnipath的有符号蛋白质-蛋白质相互作用的先验知识网络（PKN），并使用cell2location计算的支气管周围成纤维细胞特异性基因表达来计算目标细胞类型内的基因表达比例，使用这些生成PKN中节点的权重。

作为spot组成函数的细胞间依赖性分析：

• 由于细胞-细胞通讯事件不限于LRIs，进一步评估spot/生态位组成对所有基因的影响，使用NCEM。
• 为此，利用cell2location计算的细胞类型特异性基因表达。因此，NCEM建模跨spots细胞类型内表达变异作为推断spot组成的函数。
• 为将分析聚焦于生物学相关基因，选择WikiPathways数据库中描述的基因集，来自Molecular Signature Database（MSigDB），使用decoupler。
• 过滤掉使用scrapy中rank_genes_groups_df()函数计算的细胞类型特异性标记基因，调整p值<0.05和最小log fold change>2。最后，1614个基因在数据集中共享。
• 此外，22种细胞类型被考虑用于NCEM分析，包括由scCODA计算的可信差异丰度的细胞类型和最丰富的细胞类型。
• 在过滤数据集上执行类型耦合分析，基于Wald检验对线性NCEM模型学习的参数计算发送者和接收者效应，使用完整数据集并用OLS优化。
• 进一步基于特定相互作用的基因-wise效应解剖这些耦合，包括所有发送者对一接收者的效应（受体效应分析），报告涉及至少500个差异表达且q值<0.05和绝对log fold change>0.8的依赖性。
• 最后，进行发送者相似性分析以表征CD4 T细胞跨条件的发送者 profiles。

时空轨迹分析：

• 为表征AT2-AT1分化过程，利用stLearn工具，采用基于空间图的方法伪时间-空间（PSTS），结合空间和成像信息与基因表达来映射细胞状态的空间变化，建模和重建其时空轨迹。
• 简言之，PSTS整合空间spot邻接与转录相似性构建联合图，从中使用最小生成树推断空间轨迹，沿分化路径伪时间排序spots。
• 沿每个轨迹的spots分组为clades，通过PSTS推断的转录相关细胞的 distinct 空间聚类。在分析中，clade 6和clade 9是两个这样的PST衍生组。
• clade编号（如clade 6和clade 9）对应于PSTs轨迹层次聚类定义的空间聚类，如stLearn中实现。基于其转录签名和伪时间位置，聚焦与AT2到AT1转变相关的clades。
• 为准确识别与预测轨迹正或负相关的转变基因，报告Spearman相关性<0.4或>0.4的基因。
• 此外，仅选择富含AT1和AT2细胞的spots，其中这些细胞类型代表推断spot组成的最大丰度的至少70%。
• 此外，对识别的转变基因使用MSigDB中的细胞类型签名基因集进行基因集富集分析，使用超几何检验衍生的假发现率（FDR）q值。

与扩展HLCA、非COVID-19 DAD和IPF样本的比较分析：

• 为评估COVID-19-DAD相关TF活性程序的特异性，将相同的TF活性推断框架应用于扩展HLCA数据集。
• HLCA subset 到肺组织和五个感兴趣条件，包括来自257个健康样本（164个供体）的751,305个细胞，来自73个COVID-19样本（51个供体）的298,429个细胞，来自13个非COVID-19肺炎样本（13个供体）的31,923个细胞，来自67个特发性肺纤维化（IPF）样本（52个供体）的251,406个细胞，以及来自24个慢性阻塞性肺疾病（COPD）样本（18个供体）的67,943个细胞。
• 为与Visium ST分析可比，将分析限制在原始Visium分析中5850个高偏差基因中的5746个，这些基因也存在于HLCA数据集中。
• 条件特异性富集使用decoupler rank_sources_groups()与t-检验测试，该检验高估方差，参考集设置为'rest'。
• TFs按其均值变化 versus rest 在COVID-19和健康肺中相应均值变化之间的差异排序，以识别在COVID-19中优先富集相比健康的TFs。
• 为基准测试COVID-19 DAD特异性空间和细胞特征，对8个代表不同病因的非COVID-19 DAD肺组织样本进行额外空间转录组学分析。三个样本在COVID-19大流行前（2018年）收集，排除未检测到的SARS-CoV-2感染。
• 这些样本使用Visium CytAssist工作流程处理，而下游数据分析，包括预处理、细胞类型反卷积和空间共定位分析，使用与COVID-19病例相同的计算管道进行。
• 此外，重新分析公开可用的IPF和对照肺Visium数据，涵盖4例IPF患者（每例有三个组织注释纤维化程度评分从0到3）和4例健康对照。这允许评估COVID-19 DAD特异性 versus IPF相关的细胞类型丰度和空间组织模式跨增加纤维化严重程度水平。

生活很好，有你更好。