【生信分析】免疫组库基础分析1-V/D/J基因使用频率计算

三兔测序学社

发布于 2025-10-20 16:57:54

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1、研究意义

免疫组库是研究免疫系统多样性和抗体/ T细胞受体（TCR）识别特异性的关键步骤。在此过程中，V/D/J基因的使用偏向性作为重要参考指标之一，能够揭示免疫系统在不同个体或不同条件下如何选择和利用特定的基因片段，形成多样的免疫应答。V（变异）、D（多样）和J（连接）基因的组合决定了T细胞受体和B细胞受体的特异性，而这些组合的使用偏向性为理解免疫反应的机制、疾病的免疫特征以及疫苗的设计等方面提供了宝贵的线索。

2、数据预处理

2.1. 数据准备

通过高通量测序技术，如RNA-seq、TCR-seq或BCR-seq获得免疫组库数据。这些测序数据会提供每个样本中T细胞受体或B细胞受体的基因序列。

2.2. 数据预处理

为了有效分析基因的使用频率，首先需要进行数据清洗与预处理。主要步骤包括：

去除低质量序列：根据测序质量标准，去除质量较差的序列，以确保数据的可靠性。
去除冗余序列：合并重复出现的相同序列，以减少数据的重复度。
剪接/拼接序列：对V/D/J区域进行拼接和修正，以确保可以正确识别这些基因片段。

2.3. V、D、J基因注释

接下来，利用已有的免疫基因数据库（如IMGT）对每个序列进行注释，以准确识别其中的V、D、J基因。可以使用专门的工具（如MiXCR、IgBlast等）来注释这些序列中的V、D、J基因，同时会统计每个序列（克隆子）的出现的次数与使用频率。

3、下游数据分析

3.1.统计每个V、D、J基因的使用频率

当每个克隆子的V、D、J基因组成被注释，也有该克隆子的出现次数及使用频率，接下来

统计每个V、D、J基因的使用频率存在两种计算方法：

1. 以CloneCount（克隆子频率）为计量单位

这种方法基于每个测序读段（Read）的出现频率来计算V/D/J基因的使用频率。这里的关键点是将测序数据中的每个read与特定的克隆子（即基于相同DNA序列,相同V-D-J组合）关联起来。

计算步骤：

V基因使用频率：通过计算所有含有特定V基因的read所组成的克隆子频率的累加总和。例如，如果某个V基因出现了10次，那么该V基因的频率为10个read。V基因使用频率 = ∑(由该V基因组成的克隆子频率)
D基因使用频率：同样地，D基因的使用频率是由所有包含该D基因的克隆子频率的累加。D基因使用频率 = ∑(由该D基因组成的克隆子频率)
J基因使用频率：最后，J基因的使用频率是通过计算所有包含该J基因的克隆子频率的累加来得出的。J基因使用频率 = ∑(由该J基因组成的克隆子频率)

此方法的重点是基于测序中每个read的频率来度量基因的使用情况，因此通常适用于大规模测序数据。

2. 以Clonetype（克隆子数量）为计量单位

这种方法基于克隆子的数量来计算V/D/J基因的使用频率。在这种方法中，克隆子是指具有相同DNA序列，无论这些序列在数据中的频率如何。

计算步骤：

V基因使用频率：通过计算所有包含特定V基因的克隆子的数量，除以总克隆子数。例如，如果有10个克隆子使用了某个V基因，而总克隆子数为100，则该V基因的使用频率为10/100。V基因使用频率 = (由该V基因组成的克隆子数量) / (总克隆子数量)
D基因使用频率：同样，D基因的使用频率是所有使用该D基因的克隆子数量占总克隆子数的比例。D基因使用频率 = (由该D基因组成的克隆子数量) / (总克隆子数量)
J基因使用频率：最后，J基因的使用频率是包含该J基因的克隆子数量占总克隆子数的比例。J基因使用频率 = (由该J基因组成的克隆子数量) / (总克隆子数量)

这种方法的优势在于它直接关注克隆子（即由相同DNA序列构成的群体）的数量，而不是单个测序read的频率。这有助于识别更为稳定和广泛的免疫克隆，而不仅仅是看单个基因的序列出现频率。

3.2 R代码举例说明

数据准备

library(dplyr)
# 示例数据框
sequences <- data.frame(
  clone = c('ATGC', 'CGTA', 'GCTA', 'TACG', 'AGCT'),
  Clonecount = c(10, 5, 15, 8, 2),
  V_gene = c('V1', 'V2', 'V1', 'V3', 'V1'),
  D_gene = c('D1', 'D2', 'D1', 'D3', 'D1'),
  J_gene = c('J1', 'J1', 'J2', 'J1', 'J2'),
  clonefrequency = c(10/40, 5/40, 15/40, 8/40, 2/40) 
)
1. 以CloneCount（克隆子频率）为计量单位的R代码
# 计算 V 基因使用频率（基于 clonefrequency）
v_gene_freq_cumulative <- sequences %>%
  group_by(V_gene) %>%
  summarise(v_frequency = sum(clonefrequency))
# 计算 D 基因使用频率（基于 clonefrequency）
d_gene_freq_cumulative <- sequences %>%
  group_by(D_gene) %>%
  summarise(d_frequency = sum(clonefrequency))
# 计算 J 基因使用频率（基于 clonefrequency）
j_gene_freq_cumulative <- sequences %>%
  group_by(J_gene) %>%
  summarise(j_frequency = sum(clonefrequency))
# 查看结果
v_gene_freq_cumulative
d_gene_freq_cumulative
j_gene_freq_cumulative
#如果对原始输出文件进行过滤，导致clonefrequency总和不是100%，则用Clonecount.
# 计算V基因的使用频率（基于Clonecount）
v_gene_freq <- sequences %>%
  group_by(V_gene) %>%
  summarise(v_frequency = sum(Clonecount)) %>%
  mutate(v_frequency = v_frequency / sum(v_frequency))
# 计算D基因的使用频率（基于Clonecount）
d_gene_freq <- sequences %>%
  group_by(D_gene) %>%
  summarise(d_frequency = sum(Clonecount)) %>%
  mutate(d_frequency = d_frequency / sum(d_frequency))
# 计算J基因的使用频率（基于Clonecount）
j_gene_freq <- sequences %>%
  group_by(J_gene) %>%
  summarise(j_frequency = sum(Clonecount)) %>%
  mutate(j_frequency = j_frequency / sum(j_frequency))
# 查看结果
v_gene_freq
d_gene_freq
j_gene_freq

2. 以Clonetype（克隆子数量）为计量单位的R代码举例

# 计算V基因的使用频率（基于Clonetype）
v_gene_clone_freq <- sequences %>%
  group_by(V_gene) %>%
  summarise(clone_count_v = n()) %>%
  mutate(v_frequency_clone = clone_count_v / sum(clone_count_v))
# 计算D基因的使用频率（基于Clonetype）
d_gene_clone_freq <- sequences %>%
  group_by(D_gene) %>%
  summarise(clone_count_d = n()) %>%
  mutate(d_frequency_clone = clone_count_d / sum(clone_count_d))
# 计算J基因的使用频率（基于Clonetype）
j_gene_clone_freq <- sequences %>%
  group_by(J_gene) %>%
  summarise(clone_count_j = n()) %>%
  mutate(j_frequency_clone = clone_count_j / sum(clone_count_j))
# 查看结果
v_gene_clone_freq
d_gene_clone_freq
j_gene_clone_freq

总结

方法1：以CloneCount为计量单位：通过累计基因片段所代表的所有read的频率，计算出V/D/J基因使用频率。这种方法关注每个read的出现频率，适用于更精细的分析，能够反映基因的使用频率。
方法2：以Clonetype为计量单位：通过计算特定V/D/J组合的克隆子数量，计算出V/D/J基因的使用频率。此方法更侧重于克隆子之间的数量分布，能够帮助揭示免疫反应的广泛性和多样性。

选择哪种方法取决于研究目标和数据的特点。如果您关注基因使用的频率和精细的测序数据，可以使用方法1；如果您更关注克隆子的多样性和群体结构，则方法2可能更为合适

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原始发表：2025-07-05，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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