宏基因组组装实战教程 (MEGAHIT + BBMap + BWA)

天意生信云

发布于 2025-09-30 14:50:20

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在前面的文章我们用Claude code辅助完成了宏基因组测序数据的质控和去宿主Claude code做宏基因组数据质控、手把手教你指挥KneadData精准“斩断”宏基因组宿主干扰，接下来就对宏基因组数据进行组装。在宏基因组学研究中，将数以百万计的短序列（Reads）拼接成更长的连续序列（Contigs），是后续物种鉴定、功能分析和基因组分箱（Binning）的关键第一步。

本教程将涵盖三大核心环节：

De Novo 组装: 使用 MEGAHIT 将 Clean Reads 拼接成 Contigs。
组装质量评估: 使用 BBMap 对组装结果进行统计。
计算 Contig 覆盖度: 使用 BWA 和 SAMtools 为后续分箱做准备。

准备工作：环境部署

为了避免软件版本和依赖冲突，推荐使用 Conda 来管理生信软件。首先，创建一个独立的分析环境并安装所有需要的工具：

# 创建名为 "metagenome" 的新环境
conda create -n metagenome

# 激活环境
conda activate metagenome

# 一次性安装所有需要的软件
# -c bioconda 和 -c conda-forge 是指定的软件源
conda install -c bioconda megahit bbmap bwa samtools metabat2 -y

安装完成后，就可以在这个 metagenome 环境中开始分析了。

假设已经完成了质控，手头有高质量的双端测序数据：S1_clean_R1.fq.gz 和 S1_clean_R2.fq.gz。

步骤一：使用 MEGAHIT 进行 De Novo 组装

软件作用

MEGAHIT 是一款专为宏基因组设计的高效组装软件。它基于简洁的德布莱英图（Succinct de Bruijn Graph）算法，具有速度快、内存占用低的优点，尤其擅长处理高复杂度的宏基因组数据。

软件用法

MEGAHIT 的命令非常直观。我们将使用多线程来加速组装，并设置最小 Contig 长度为 1000 bp，这是宏基因组分析的常用标准，可以有效过滤掉过短、无意义的片段。

# 运行 MEGAHIT 组装
megahit \
    -1 S1_clean_R1.fq.gz \
    -2 S1_clean_R2.fq.gz \
    -o S1_megahit_out \
    -t 24 \
    --min-contig-len 1000

# 参数解释:
# -1, -2: 分别指定双端测序的 R1 和 R2 文件。
# -o: 指定输出结果的目录名。
# -t: 指定使用的线程数，根据你的服务器配置调整。
# --min-contig-len: 设置输出 Contig 的最小长度阈值（单位：bp）。

运行结束后，最重要的输出文件是 S1_megahit_out/final.contigs.fa，这就是我们得到的组装好的 Contigs 文件，后续所有分析都将基于它。

步骤二：使用 BBMap stats.sh 评估组装质量

软件作用

组装完成后，我们需要评估其质量。BBMap 套件中的 stats.sh 是一个轻量级但功能强大的工具，可以快速计算 N50、Contig 数量、总长度等关键指标。

软件用法

stats.sh 默认输出人类易读的格式，但通过 format=5 参数，我们可以得到一个制表符分隔的、机器易读的格式，方便后续脚本处理。

# 运行 stats.sh 进行统计
stats.sh in=S1_megahit_out/final.contigs.fa format=5 > S1_assembly_stats.txt

# 参数解释:
# in=: 指定输入的 FASTA 文件。
# format=5: 输出为5列格式（n_scaffolds, n_contigs, scaf_bp, contig_bp, gap_pct）。
# >: 将标准输出重定向到文件 S1_assembly_stats.txt。

打开 S1_assembly_stats.txt 文件，就会看到类似下面的内容，其中 N50 是衡量组装连续性的核心指标，值越高通常意味着组装效果越好。

#n_scaffolds   n_contigs       scaf_bp         contig_bp       gap_pct     scaf_N50   scaf_L50  ...
150000         150000          350000000       350000000       0.00        25000      28000     ...

步骤三：计算 Contig 覆盖度（为分箱做准备）

软件作用

宏基因组分箱（Binning）的目的是将属于同一个物种的 Contigs 聚类成一个基因组草图（MAG）。分箱算法（如 MetaBAT2）依赖两个核心信息：序列组成特征（如四核苷酸频率）和覆盖度信息。

来自同一个物种的 Contigs，其在样本中的丰度应该相似，因此它们的测序深度（覆盖度）也应该相近。此步骤就是为了计算每个 Contig 的平均覆盖深度。

这个过程是一个经典的比对流程：

BWA-MEM: 将原始的 Clean Reads 比对回我们自己组装的 Contigs 上。
SAMtools: 对 BWA 的比对结果（SAM/BAM 文件）进行格式转换、排序和索引。
MetaBAT 工具: 从排序后的 BAM 文件中提取每个 Contig 的平均深度。

软件用法

这是一个三步走的流程，我们通常用管道符 | 将它们连接起来，以提高效率。

为 Contigs 创建索引（只需运行一次）

# BWA 需要先对参考序列（这里是我们的 Contigs）建立索引
bwa index S1_megahit_out/final.contigs.fa

比对、排序并计算深度

# 定义文件名变量，方便后续使用
CONTIGS="S1_megahit_out/final.contigs.fa"
BAM_OUT="S1_mapping.sorted.bam"
DEPTH_OUT="S1_contig_depth.txt"
THREADS=24

# 核心命令：比对 -> 转 BAM -> 排序
bwa mem -t ${THREADS} ${CONTIGS} S1_clean_R1.fq.gz S1_clean_R2.fq.gz | \
  samtools view -@ ${THREADS} -bS -F 4 - | \
  samtools sort -@ ${THREADS} -o ${BAM_OUT} -

# 参数解释:
# bwa mem -t: 使用多线程将 reads 比对到 contigs。
# |: 管道符，将上一步的输出作为下一步的输入。
# samtools view -bS -F 4: 将 SAM 格式转为 BAM，-F 4 过滤掉未比对上的 reads。
# samtools sort -o: 对 BAM 文件按坐标排序，并输出到指定文件。

# 3. 从排序后的 BAM 文件中计算覆盖度
# jgi_summarize_bam_contig_depths 是 MetaBAT2 自带的脚本
jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth ${DEPTH_OUT} ${BAM_OUT}

# 参数解释:
# --outputDepth: 指定输出的深度文件。
# 最后一个参数是输入的 sorted BAM 文件。

运行结束后，将得到一个名为 S1_contig_depth.txt 的文件，内容格式如下：

contigName      contigLen       totalAvgDepth   S1_mapping.sorted.bam
contig_1        54321           15.78           15.78
contig_2        43210           89.12           89.12
...

这个文件包含了每个 Contig 的名称、长度和平均覆盖深度，是进行分箱分析的关键输入之一。

总结与展望

至此，你已经完成了宏基因组数据从原始 Reads 到结构化 Contigs 的核心处理流程。

S1_megahit_out/final.contigs.fa (组装好的 Contigs)
S1_contig_depth.txt (Contigs 覆盖度文件)

有了这两个文件，就可以进入下游分析阶段，例如使用 MetaBAT2、MaxBin2 等工具进行基因组分箱 (Binning)，从而重构出样本中微生物的基因组草图（MAGs），进而探索它们的物种身份和功能潜力。

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原始发表：2025-09-18，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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