关于（单细胞）转录组检测突变的总结与局限性

作者，Evil Genius

最近各个公司加大力度抢占市场，做单细胞的价格一路走跌，对于科研工作者来说，算是个好消息，但是也就到这儿了，价格低往往对应的售后差，拿到数据后如何进行有效分析，目前公司很难满足需求，而与公司进行合作项目，那费用够课题组培养好几个分析人员了。

这一篇我们来分享一下为什么WGS/WES + sc/snRNA是目前最好的多组学方案。

大家通常所谓的风口，其实就是技术可以、做的人少，发文质量高。

大家觉得多组学（基因组 + 单细胞、单细胞 + 空间、单细胞 + 代谢等等）算现在的风口么？

现在接触的大多数学员、粉丝好像对基因组 + 转录组的多组学方案并不感兴趣，但是这种文章已经越来越多了，谈不上是什么风口了，但也还行，多组学比单一组学文章质量好得多。

单细胞转录组检测突变的内容其实早就不新鲜了，目前已经有很多文章发表，不乏正刊、顶刊，方法也有很多，包括cellsnp-lite、SCmut、SComatic、scVarScan、Monopogen等，最友好的是cellsnplite，我自己也总结了很多，大家可以参考文章

知识分享--关于单细胞空间数据检测突变的方法汇总

顶刊复习--肺腺癌上皮细胞状态和可塑性图谱（突变 + 单细胞）

内容补充--关于单细胞空间检测突变的相关内容

多组学文献分享---Mosaic Focal Cortical Dysplasia单细胞基因分型和转录组学分析（突变 + 单细胞 + 空间）

月底总结----关于单细胞空间数据检测突变的内容汇总

文献分享---差异染色质可及性和转录动力学定义乳腺癌亚型及其谱系（突变 + scRNA + scATAC + 空间）

顶刊分享---肿瘤进化和微环境相互作用（突变 + 单细胞 + 空间）

课程丰富----单细胞联合突变的信息分析

课程补充----关于单细胞空间外显子分析的突变空间微环境解析

课前准备----高通量单细胞分析数据集中的体细胞突变检测

课后补充----单细胞突变分析的高分文章运用

课前准备--单细胞突变矩阵的获得与有害位点的识别

课程上也讲过很多，在

2024第一课：单细胞联合突变信息分析

2024年的单细胞、WES突变的检测课程也都送给25年的学员了。

那么到了这里，其实我们就要分享其中的局限性了。

因为检测突变、SNV等内容是基因组的事情，单细胞转录组的检测都有哪些局限性？

1. 测序覆盖度与深度不足（最核心的局限）

问题：10X标准文库构建的目标是获取细胞标签（Barcode）和UMI，并对转录本3’端进行测序。每个细胞的测序量通常仅为50,000-100,000条读段，这些读段分散在成千上万个基因的3’端。

后果：对于任何一个特定的基因位点，覆盖度都非常低。可能一个细胞在某位点上只有寥寥几条甚至零条读段覆盖，这使得突变检测信噪比极低，漏检（假阴性）率非常高。你只能检测到那些高表达基因中的高频突变。

RNA-Seq只能检测正在表达的基因中的突变。

如果一个突变发生在不表达或表达量极低的基因中，或者发生在非编码区（如调控区域），RNA-Seq根本无法捕获到它。这会造成大量的假阴性.

2. 基于液滴的系统特有的技术偏差

扩增偏倚（Amplification Bias）：10X技术需要经过RT-PCR和PCR扩增，这个过程并非完全均匀，会引入随机误差并导致某些等位基因优先扩增。

等位基因脱扣（Allelic Dropout, ADO）：由于起始RNA量极少，扩增的随机性可能导致一个等位基因完全未被检测到，从而将杂合突变误判为野生型或纯合突变。这是假阴性的一个重要来源。

高错误率：逆转录和PCR步骤会引入核苷酸错误。虽然UMI可以校正后续PCR duplication引入的错误，但逆转录和第一轮PCR的错误是无法通过UMI纠正的，这会导致假阳性。

3. 仅限表达基因的3’端区域

问题：只能检测正在表达的基因中的突变。不表达的基因、调控区域或内含子的突变无法检测。

3’端偏好性：测序集中在转录本的3’末端，这意味着如果一个关键突变（如 TP53 的DNA结合域突变）位于基因的5’端编码区，而该转录本在3’端覆盖度不足，那么这个突变很可能被漏掉。

4. 生物信息学分析的复杂性

需要专用工具：标准的基因组或转录组突变Caller（如GATK）不适用于单细胞数据，因为它们无法处理ADO、高错误率和极低覆盖度的问题。

分析流程复杂：需要专门的、为scRNA-seq数据设计的工具，如：

Monoppogen：利用群体连锁信息来提高单细胞SNV检测的灵敏度。

VarTrix：从10X Cell Ranger的BAM文件中提取已知位点的基因分型信息。

SCAN2：一种专门为单细胞测序数据设计的 somatic SNV Caller。

极高的假阳性/假阴性率：必须进行极其严格的过滤，并且强烈建议通过正交实验（如基于同一群体的DNA测序）进行验证。

基因组 + 10X单细胞转录组（scRNA-seq）的多组学整合分析。这样既能获得准确的基因型，又能关联到丰富的表型信息，实现真正意义上的精准解析。

那么基因组检测变异的流程是什么？感兴趣的话可以参加一下9月的基因组培训班。

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