【Cell】R-Loop 从生理到病理（二）

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防止非自发的R环积累的因素

从最初在酵母THO复合体突变体中的观察（Huertas和Aguilera，2003年）开始，后续的报告支持了其他RNA处理/出口因子在防止DNA-RNA杂交中的作用（Li和Manley，2005年）（表1），提出在真核细胞中，DNA-RNA杂交体通过涂覆参与处理和出口的新生RNA分子来防止（图2A）。突变菌株中非计划DNA-RNA杂交体的积累与基因组不稳定性的增加有关，这通过超突变、超重组、大染色体重排或不同形式的复制压力来确定（Aguilera和Garcı ́a-Muse，2012年）。防止杂交体积累的保护作用并不是所有RNA结合和处理因子的属性，而只是一部分因子的属性，这些因子可能在转录延长期间功能于mRNA蛋白质粒子的组装。

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第二个关键因素是DNA拓扑结构，它影响新生RNA与DNA模板杂交的能力（图2A）。因此，转录RNA聚合酶后面瞬时产生的负超旋使DNA链分离，双链DNA易于打开，从而促进DNA-RNA杂交体的形成，正如在拓扑异构酶I耗尽的细菌、酵母和人类细胞中的体外和体内观察到的（Drolet等人，1995年；El Hage等人，2010年；Tuduri等人，2009年）。符合这个观点的是，大多数DNA-RNA杂交体是在转录过程中发生的。

转录是R环形成的必要前提，此外，R环的水平与正常细胞中的高转录水平相关 (Chan等人，2014; Stork等人，2016; Wahba等人，2016)。然而，并非所有情况下高转录水平都会确保DNA-RNA杂交体的形成。一些R环累积突变体显示出严重的转录缺陷 (Hraiky等人，2000; Huertas和Aguilera，2003)，其中一些可能会被DNA-RNA杂交体本身加剧。事实上，DNA-RNA杂交体对转录延长有负面影响 (Tous和Aguilera，2007)，R环诱导与转录暂停相关 (Chen等人，2017)。此外，由于RNA出口不足导致的核内RNA累积并不足以诱导DNA-RNA杂交体的累积 (Garcı ́a-Rubio等人，2018)。因此，尽管高转录增加了杂交体形成的机会，但R环的累积并不仅仅是高转录的结果。

新的数据也支持染色质是防止R环累积的另一个因素 (图2A)。染色质控制R环稳态的实验证据是在酵母S. cerevisiae中提供的，其中对非致命的组蛋白H3和H4突变体库进行筛查，发现了一些特定的H3和H4突变，它们大大增加了R环的累积 (Gar- cia-Pichardo等人，2017)。将哺乳动物基因组中的R环图谱与DNAase I超敏感性图谱进行比较发现，R环阳性区域与"开放染色质"的相关性比R环阴性区域更好 (Chen等人，2017; Sanz等人，2016)。根据更容易接触的DNA有利于DNA-RNA杂交体的形成，人类细胞在处理组蛋白去乙酰化酶抑制剂或耗尽SIN3A组蛋白去乙酰化酶 (HDAC)复合体后，杂交体会累积 (Salas-Armen- teros等人，2017)，在酵母sin3D突变体中也是如此 (Wahba等人，2011)。SIN3A组蛋白去乙酰化酶与其他去乙酰化酶的特定作用尚待确定，但值得注意的是，SIN3A与RNA处理/出口因子THO复合体相互作用，这暗示THO防止R环的形成不仅通过促进最佳的mRNP的形成，而且通过促进局部的转录期间的组蛋白去乙酰化 (Salas-Ar- menteros等人，2017)。这个结果提出了一种可能性，即有一个保障转录期间的机制，即特定的蛋白质如THO复合体绑定到新生的RNA，因为它从RNAP中出现，并与Sin3A交谈以瞬时去乙酰化组蛋白，从而关闭染色质。相反，较不易接触的异染色质显现为R环的对手。在这方面，异染色质标记，如组蛋白H3赖氨酸9的二-和三-甲基化 (H3K9me2/3)，已与C. elegans中DNA-RNA杂交体的低发生率相关联 (Zeller等人，2016)。此外，已报道Drosophila细胞耗尽组蛋白H1，表现出异染色质缺陷时，R环水平增加 (Bayona-Feliu等人，2017)，在用拓扑异构酶抑制剂诱导染色质解聚的小鼠细胞中 (Powell等人，2013)，或在S. pombe细胞中删除了SNF2样核小体重塑因子Fft3，这会改变异染色质的维持，并带来主要的组蛋白更新 (Taneja等人，2017)。区分染色质对R环的保护作用与在S. cerevisiae，S. pombe，C. elegans和人类细胞中看到的R环与特定染色质标记之间的关联是重要的。事实上，不同的研究表明，R环可以间接影响染色质，通过调控染色质调节复合体的结合 (Arab等人，2019; Chen等人，2015)。因此，R环和染色质结构如何影响或关联将取决于它们的生理或病理影响。

解决R loop的因素

尽管有所有直接阻止R环在转录期间形成的机制，但有时它们无法阻止R环的形成，尽管频率很低。因此，细胞发展出了备份机制来解决R环，并避免它们的累积和对转录和基因组完整性的潜在威胁。可能最相关且最知名的具有这种功能的因子是RNase H，它是从细菌到人类的保守性核糖核酸酶，能够特异性地降解RNA:DNA杂交体的RNA部分，如前所述(图2B)。原则上，两种类型的RNase H，RNase H1和RNase H2，都能解决杂交体，后者还参与核糖核苷酸切除修复(RER)。然而，RNase H的关键作用是去除Okazaki片段中DNA-RNA杂交体的RNA引物。这是一种高效的解决R环的备份机制，这一观察得到了细菌、酵母和人类细胞耗尽或对RNase H1无效的观察支持。此外，RNase H1过表达有效抑制了与R环相关的特异性表型，或消除了S9.6抗体检测到的DNA-RNA杂交信号 (Drolet等人，1995; Huertas和Aguilera，2003; Li和Manley，2005; Wahba等人，2011)。然而，RNase H的过表达是一种人为条件，不能排除过多的RNase H可能作用于某些不一定是其主要自然靶标的杂交体。鉴于非预定的R环可能在转录期间形成，通过降解新生RNA来解决它们似乎非常耗费资源，尤其对于可以达到超过600 kb长度的人类基因。

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近年来，许多报告已经确认了越来越多的RNA依赖性ATP酶，其中一些已经被证实在体外有DNA-RNA解旋活性，当从细胞中消除时，会导致DNA-RNA杂交体的积累。这些包括人类的SETX和FANCM及其酵母同源物Sen1和Mph1，AQR，DDX19，酵母Pif1，DDX23，DDX1，Dbp2（人DDX5），Sgs1（人BLM）等（Chang等人，2017; Cristini等人，2018; Hodroj等人，2017; Lafuente-Barquero等人，2017; Li等人，2016a; Mischo等人，2011; Ribeiro de Almeida等人，2018; Skourti-Stathaki等人，2011; Sollier等人，2014; Sridhara等人，2017; Schwab等人，2015; Tedeschi等人，2018; Tran等人，2017; Wang等人，2018b）（表1）。这些结果表明，DNA-RNA解旋酶构成了去除R环的第二种类型的因子（图2B）。SETX已被涉及到去除位于终止子处的R环（Skourti-Stathaki等人，2011）。敲低AQR，一种DEAxQ样的假定RNA/DNA解旋酶，导致R环的积累以及R环依赖的DNA损伤（Sollier等人，2014）。DDX19是一个能够在体外解旋DNA-RNA杂交体的核孔相关mRNA导出因子。基于观察到缺乏DDX19的增殖细胞显示出R环和DSBs的增加，人们提出DDX19作用于复制应激或DNA损伤时形成的R环（Hodroj等人，2017）。此外，已经显示出RNAPII在R环积累位点的暂停引发了一个信号级联，最终在DDX23 RNA解旋酶的磷酸化，其招募到暂停位点，和R环的溶解（Sridhara等人，2017）。就像其他一些例子，比如Pif1，BLM和Sgs1，DDX9，或FANCM，也显示出了体外DNA-RNA解旋活性。其他解旋酶，如RECQL5，似乎的作用方式不同。RECQL5防止转录相关的基因组不稳定（Saponaro等人，2014）。在RECQL5消耗的细胞中，R环积累，并且RNase H的表达减少了DNA断裂的数量。然而，需要解旋酶领域，而不是解旋酶活性，来抑制R环，已经提出RECQL5促进TOP1活性（Li等人，2015）。

RNA解旋酶在解决R环中的作用在概念上具有吸引力，因为与RNases H相比，解旋酶可以在不需要代价高昂的降解新生RNA的情况下解决杂交体。然而，大多数这些酶并未被证明能比双链RNA更好地解旋DNA-RNA杂交体。最重要的是，尚未确定所有这些解旋酶是否在体内解旋杂交体，例如，过度表达它们并显示杂交体和任何依赖R环的表型的减少。为什么细胞需要这么多不同的非冗余的DNA-RNA解旋酶呢？一个可能的解释是每个解旋酶都作用于特定子集的DNA-RNA杂交体。或者，大多数这些蛋白质可能在体内作为RNA分子伴侣而不是DNA-RNA解旋酶，它们通过促进一个最佳的mRNP防止R环的形成，这个mRNP无法与其DNA模板杂交，就像THO的情况一样。

有趣的是，两个最近的DNA-RNA杂交体拉下的蛋白质组学分析报道了在DNA-RNA杂交体结合部分富集的350多个因子。其中，有25多个DEAD-box解旋酶，包括上述的那些（Cristini等人，2018; Wang等人，2018b）。两项研究都发现了在体内参与R环代谢的因子，但是由于两项研究之间的一致性程度很低，并且在S9.6拉下中没有检测到RNase H（Cristini等人，2018），因此仍需要进一步的验证分析。实际上，对这些蛋白质的作用进行进一步结论还有一些限制。例如，一个拉下是在包含可能刺激DNA-RNA杂交体的自由末端的线性DNA-RNA底物上进行的，因此，至少有一部分被鉴定的蛋白可能与这样的末端结合，如连接酶LIG3的情况。此外，许多被鉴定的蛋白并未与RNA代谢相关，如DNA解旋酶MCM5，组蛋白甲基转移酶NSD2，核基质蛋白MATR3或肌球蛋白MYO1，这使得它们在DNA-RNA杂交体代谢中的作用，如果是真的，很难解释。无论如何，这些杂交体相互作用体提供了一种吸引人的工具来探索R环生物学。

持久的R环可以构成转录的障碍，这已被提出来解释细菌topA或酵母THO复合体突变对转录的负面影响(Hraiky等人，2000; Huertas和Aguilera，2003)。因此，必须存在一种机制来移除这种障碍。由于堆叠在DNA损伤位点（如环丙嘧啶二聚体[CPD]）前的RNA聚合酶引发了转录偶联修复（TCR）过程，解决R环-转录冲突的一种可能机制是TCR样机制可能促进R环的移除以允许转录恢复。然而，到目前为止，还没有任何报告指出这种功能或类似TCR的机制的存在。

R环也是RF进展的障碍，这是细胞周期中S-G2阶段R环相关基因组不稳定性的主要原因 (Crossley等人，2019; Go ́ mez-Gonza ́ lez和Aguilera，2019)。滞后的RF需要被保护以避免它们的崩溃和结果的DNA断裂。因此，不同的修复因子和途径起作用以允许RF重新启动。一种机制依赖于Fanconi贫血（FA）通路的成员，这是由一组复杂的因子组成的，这些因子主要在互链交叉联（ICLs）修复的上下文中进行了研究，但对任何类型的阻碍复制的DNA损伤都是活跃的。值得注意的是，FANCD2、FANCA、FANCM和BRCA2等FA因子被耗尽的细胞会累积R环和依赖R环的DNA断裂 (Bhatia等人，2014;Garcı ́a-Rubioetal.,2015;Hatchietal.,2015;Liangetal., 2019; Madireddy等人，2016; Okamoto等人，2019; Schwab等人，2015)。重要的是，抑制转录或过表达RNase H1都能减少R环的累积，抑制FANCD2耗尽的细胞中的RF停滞和DNA损伤 (Garcı ́a-Rubio等人，2015; Schwab等人，2015)。FANCD2病灶形成，这是激活这个修复途径的第一步，大部分是依赖R环的，即使在没有DNA损伤的情况下。体外实验已经显示，FANCI-FANCD2复合物结合被置换的ssDNA和ssRNA尾，这种底物通过单泛素化刺激FANCD2的激活，支持FA通路在含有R环的位点起作用的观点 (Garcı ́a-Rubio等人，2015; Liang等人，2019)。据提议，FANCM，属于DEAD家族的DNA-RNA解旋酶，可以移除R环，因为它在体外解旋DNA-RNA分子 (Schwab等人，2015)。然而，最近还显示出FANCD2与RNA处理因子（包括DEAD-box RNA解旋酶DDX47）相互作用，这可能促进R环的移除 (Okamoto等人，2019)。如何每一个这些蛋白质运作以促进R环的移除仍然不清楚。

我们尚未阐明BRCA因子和FA途径如何溶解导致DNA损伤的R环的机制。原则上，FA途径可能像处理ICLs一样切割并消除杂交的DNA链。在FA和DSB修复因子BRCA2的情况下，有人提出它通过直接作用于R环来帮助移除杂交体，只要这部分类似于阻塞的RF (Bhatia等人，2014)。有趣的是，BRCA2绑定到DSS1和PCID2，其酵母同源体属于参与mRNP生物合成和输出的TREX-2/THSC复合物，这可能暗示了一个不一定与复制相关的角色。可能BRCA2也作用于解决R环或处理由它们引发的损伤 (Bhatia等人，2014)。此外，另一个FA因子BRCA1在一部分转录终止区域富集，这些区域积累了R环，并介导解旋酶SETX的招募 (Hatchi等人，2015)。因此，BRCA2和BRCA1促进R环移除的机制不一定相互关联。鉴于它们作为FA和DSB修复因子，以及保护滞后叉子不崩溃的角色，它们也可能作用于在DSBs处积累的杂交体（见下文）。在这个能力中，通过促进DSB修复，它们也会帮助移除杂交体（见下文）。实际上，DNA-RNA杂交体作为复制压力和基因组不稳定性的自发背景源，可以通过DNA修复间接消除，这得到了观察的支持，即沉默DNA损伤应答（DDR）和DNA修复基因（ATR、ATM、CHK1、CHK2、UBE2B和RAD18）会导致DNA-RNA杂交体的积累 (Barroso等人，2019)。许多基因组不稳定性病况，无论它们是否由DDR或修复的失败引起，都可能与DNA-RNA杂交体的积累有关，这些杂交体先于自发的DNA断裂。

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总的来说，尽管我们对DNA复制和修复功能如何帮助去除R环并防止R环介导的基因组不稳定性的知识非常有限，但除了直接参与R环预防（RNA生物合成因子，染色质）和解决（RNase H，DNA-RNA解旋酶）的细胞功能外，特定的DNA修复途径可能构成了一种备份机制，用来溶解在S-G2期间积累的R环，无论是在RF停滞还是在我们下面讨论的DSBs处。至于这是否与其他蛋白质（如DDX47，SETX，PCID2或其他）一起协同作用，正如人们对FANCD2，BRCA1，BRCA2和其他DNA修复因子所提出的那样，目前还不清楚（表1）。

未完待续

文章来源：doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.055