🤩 scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程（初步Normalization）（十）
🤩 scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程（初步Normalization）（十）
1写在前面
之前我们在质控（QC）篇介绍了Normalization的重要性。😘
scRNAseq是一个高维度的数据，相对比较复杂，不同细胞，不同平台,相差较多，所以library大小差异较大，我们需要做一个Normalization，常用方法包括：👇
UQ, SF, CPM, RPKM, FPKM, TPM。🤒
Note! 如果你使用的是Cufflinks或者RSEM进行定量。
恭喜你, 不需要normalization,因为这类方法已经考虑到的library大小不同的问题了。
2用到的包
rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(SingleCellExperiment)
library(scater)
library(scran)
library(scRNA.seq.funcs)
3示例数据
这里我们用一下之前介绍的counts文件和annotation文件，然后通过SingleCellExperiment创建SingleCellExperiment格式的文件，并且经过初步过滤，ID转换等。
load("umi_umiqc.Rdata")
umi.qc
4PCA-rawdata
这里我们用取过log后的raw_counts进行PCA绘图。
umi.qc <- runPCA(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw")
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
5PCA-CPM
这里我们先做一个CPM，然后取log,再做一下PCA。聚类明显要好一些了！😂
logcounts(umi.qc) <- log2(calculateCPM(umi.qc) + 1)
umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
6RLE-rawdata
这里我们引入一个新的可视化方式，叫relative log expression (RLE) plots。
先对raw_counts做一个RLE plots吧, 这里可以看出有明显批次效应。
plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw",colour_by = "batch") + ggtitle("RLE plot for logcounts_raw")
7RLE-CPM
再看一下CPM后的结果吧，非常明显！🥳
plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch") + ggtitle("RLE plot for log2(CPM) counts")
8其他方法
基于CPM的Normalization方法，或者其他类似的方法，有一个前提，就是假设所有细胞含有相似数量的RNA，但这有时候是不对的。🤒
这里我们介绍一下scran包，通过反卷积的方法进行Normalization。🤗
8.1 聚类
qclust <- quickCluster(umi.qc, min.size = 30)
table(qclust)
8.2 计算sizefactor
接着我们来计算一下sizeFactor，用于后面的Normalization。🧐
umi.qc <- computeSumFactors(umi.qc, clusters = qclust)
8.3 正式Normalization
开始log和Normalization。🤩
umi.qc <- logNormCounts(umi.qc)
8.4 可视化-PCA
umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch",size_by = "detected", shape_by = "individual")
8.5 RLE plot
plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch")
8.6 补充一下
如果你已经做过Normalization，再做一次的话，这个size factors会是负数，严重影响你的结果。🫠
我们可以check一下。✌️
summary(sizeFactors(umi.qc))
9downsampled data
这里再介绍一个scRNA.seq.funcs包的Down_Sample_Matrix函数。
采用了downsample，降采样的方法，具体概念不介绍了，大家自行google。
9.1 PCA
logcounts(umi.qc) <- log2(Down_Sample_Matrix(counts(umi.qc)) + 1)
umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc,colour_by = "batch",size_by = "detected", shape_by = "individual")
9.2 RLE plot
plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch")
最后祝大家早日不卷!~
腾讯云开发者
