2024第21课：空间基因梯度原创

好，哎，我们来上我们的第21课啊。我们来上我们的第21课啊。外处理的细胞数目100万可以吗？应该不可以啊。达不到那么大的重量。不过现在的好像开发了一个高通量的方法，你可以看看，就是能处理高数据量的方法。好了啊，我们来上我们的第21课，关于空间基因梯度的问题。哎，上课之前呢。哎，我们简单的先讨论一个，哎，比较。哎，比较这个。哎，复杂的问题。首先呢，就是说。哎，我们这个空间数据能像单细胞那样做那个。呃，类似于monco啊那种轨迹分析吗。哎，大家想一下啊，能不能做。能不能做呢？

我们在讲这个单细胞这个哎系列的个性化分析之上，给大家说了一个，哎，简单的过了一下关于单细胞的一个个性化分析。其中提到了单细胞在做轨迹分析的时候，哎，我们要哎找一些发育基因，比如说高变基因等等，来拟合它的一个发育轨迹。前提哎是我们要先做这个细胞定义对吧。做好细胞定义之后呢，挑选出具有发育关系的细胞，才能用于轨迹分析。那么回到我们空间赛来讲，空间符不符合，哎，这些条件呢？首先我们来看第一个关于微字母的，就是55μm精度的，哎，这个符不符合呢？哎，很明显，哎是不符合的啊。55μm呢，它包含了2~10个细胞左右。I很可能是不同的细胞类型。那么用这种mon考的方法来处理这个微的数据显然是有问题的。

哎，显然是有问题的，只有在那种哎，非常致密的组织，哎，可以试一下，不过目前文章上来看，很少有用的，几乎没有啊。那么对于HD数据呢？嗯，HD数据可不可以。上节课在提到这个关于空间转录组的一些个性化分析之中，啊，关于HD的一个。关于HD的一个处理方式呢，现在比较公认的都是那种，哎。借助于图像分割，哎，分割到具体的细胞。以2μm作为一个像素，哎，如果它在细胞内，就保留，如果它在细胞外，哎，就舍弃，然后细胞和细胞之间的边界。哎，也都识别出来这样啊，尽可能拿到这个接近单细胞级的一个空间数据。对吧，那么如果我们拿到是这一类数据。哎，理论上讲是可以做轨迹分析的。

比如说我把其中识别到的T细胞，哎，都给挑选出来，对吧，然后做一个轨迹分析，哎，那么这样的分析呢，一方面不仅仅是拿到了这个。哎，不仅仅是拿到了什么。哎。这个它的发育轨迹就是T细胞由什么细胞类型哎演化成哎，另外的什么细胞类型等等等等这样的演化轨迹。另一方面，也可以拿到它的空间轨迹。也就是说，细胞类型在演化的过程中。哎，他有哪个位置移动到了哪个位置，哎，这个就拿到了。不过呀，目前HD啊方法还尚未很成熟啊，所以说没有说售后做这个关于轨迹分析的一些内容。哎，首先第一步前，呃，前面提到的那个关于那个图像识别的内容啊。啊，这个内容做起来就比较复杂了啊，一般现在公司还没有真正的把这个图像识别联合HD的这样一个方法啊。

放进流程里还是默认的那10乘的那种8μm16μm那种模式啊，这种模式目前来讲并不精准啊。啊，能用是能用，就像之前说的一样，能用是能用，如果真正的准确是完全对的，哎，就像图像识别一样，完完整整的识别这个细胞的轮廓，这样是100分的话。完全的错，是0分的话，哎，简单粗暴的8μm16μm合并，哎，是60分。哎，如果我们结合图像信息。把2μm作为一个精度，哎，拿到接近单细胞级的一个空间数据，那么这种做法呢，是85~90分啊。那么在第二种做法之下，就是结合图像识别的HD数据，诶，是可以做轨迹分析的啊，理论上讲是可以啊，目前没有接到这种售后啊，效果如何还不太清楚，不过潜力来讲非常大啊，非常大一方面，哎呀，这个时候如果我也我用我们用这个HD数据做轨迹分析。

啊，那真真正正拿到的就是时空轨迹了啊。相当的一个重要的一个分析点啊。那么Z内部可不可以呢？就是原位的那些平台可不可以呢？啊，这个要和大家的情况而论了，如果说大家那个原位平台仅用了几十个探针。啊，基因数太少了，这是不可以的啊，几百个探针呢？哎，这也这也不太可能，但是有人这么做。啊，目前没有高分文章采用这种方式啊，就是说ZM的就是原位的这种，但是如果大家用现在用这种5000探针的。或者6000滩人呢？哎，他们的信息量足够的话，那么做这种轨迹也是可行的啊，也是可行的。哎，这就是关于空间轨迹分析的一些内容啊，目前来讲，对于空间做这种发育轨迹啊，很少啊很少。对于我们真正的空间基因轨迹啊，通常来讲是什么呢？

通常来讲是空间轨迹更多一点啊，空间轨迹更多一点。他一个真正的，哎，最典型的一个应用是什么呢？就是损伤。哎，比如说我们拿一个老的切片，哎。拿针扎了一点，或者说注射了什么溶剂之后。哎，损伤之后呢，必然会引起这个损伤部位啊，有一些这个，哎基因上的变化，那么基因上的变化呢，它能扩散到多远。空间的范围有多远？哎，这个就是我们所要研究的这个基因轨啊，基因层级分析了就是基因就是这个空间基因梯度。这个研究的内容是什么呢？因为啊，我们无论是人还是小鼠，还是其他动物吧。哎，我们每天都在受到着各种各样的损伤。哎，只不过有的损伤很轻，我们人体会自我修复，那么损伤很重呢？

哎，损伤很重，怎么办呢？如果从这个形态学上来看。哎，可能会划分出一定的区域，哎，比如说这个区域是吧，但是我们如果真正从基因的角度来看，就是说它受受损，哎，表达的一些基因啊。它的一个影响的范围有多大？哎，这个边界才是真正的一个基因梯度的一个边界啊，这里面我们我做了一个简单的梳理啊，就是说对伤口损伤的。小鼠大脑皮层，哎，进行空间转录组梯度分析之后啊，空间梯度分析是从损伤的核心部位，也就是这个地方。哎，这个地方是受损伤的一个地方。哎，深红色的点向周边浅红色的点区域内进行分析。哎，这是一个典型的事例啊，典型的事例。大家可以看到，哎，通常来讲，我们这个一般在什么方向用呢。一般在研究基因调控的时候，会有这样一个，哎，会有一个明显的这样一个研究啊，因为损伤修复啊很可哎，损伤修复啊，很多时候啊，在基因层面啊，研究的比较少啊，比较少，那关于基因梯度，它能影响多大的范围，对它的一个认知啊。

还比较的浅，还比较的浅，就像这样一样。我们在受受损伤部位啊，有一些基因是。哎，冥显高表达的对吧，冥显高表达的，但是这个基因的影响的范围啊，随着距离的远，哎，随着距离的拉远，在慢慢的诶下降下降下降下降到一定程度之后啊，哎，这个受受损啊就没有，哎就不影响这个正常的生理功能。那么对于损伤来讲，这个就是最关键的一点，哎，我就想知道它受损的部位有多大。哎，受损的部位有多大。哎，随着通过这种这个哎三软土啊，研究这个核心部位，就是这个受损伤部位，随着这个距离的远近呢，基因表达的一些变化，尤其是损伤基因表达的一些变化。

哎，这个就是我们研究空间基因梯度一个比较典型的例子啊，典型的例子。右边这边呢，给了大家一个简单定义，哎，空间这个等级的一个分析啊，就是可视化单个基因或者基因级的表达模式，哎这种表达模式呢，从一个地方我们指定一个地方，比如说损伤的地方，哎，它随着距离的拉远。哎，随着核心的扩散，它的一个哎，空间表达的一个哎等级是怎样一种变化。哎，这就是空间基因梯度了。这个呢，是典型的空间基因梯度的一个展示的一个模式啊，大家看到这个地方呢，哎，是我们的受损部位，受损部位。哎，受损部位呢，随着它受损，哎，拿到了外界的刺激，它本身啊，基因上就会有一些明显的变化。哎，那么从这个基因上来讲，它有空间的基因的梯度。

哎，那么基因的变化，哎，最直观的影响是什么呢？啊，就是细胞的变化，大家可以看到这个图，从这个受损伤的这个部位开始，哎，受损伤的这个部位开始，它的细胞类型排布。就开始发生变化啊，然后呢，通过我们这种基因梯度，哎，类似于基因这个叫细胞梯度了，通过这样的一个分析呢，就可以得到从核心部位到哎远离的地方，它的细胞的负极程度。哎，以及排布的变化。啊，这个就是简单的关于基因梯度和细胞梯度的一个简单的应用啊。呃，这个地方体现的主要是呢，哎，我们外界受到损伤之后啊。基因表达到底发生了怎样的变化，以及细胞的排布，当然了，像免疫细胞，它会聚集在伤口处来修复它，哎，一些其他的细胞呢？比如说小鼠脑受损伤之后，他的神经细胞是怎样一个影响呢？神经细胞受损的神经元到底在多大的范围之内？

哎，属于这个损伤的部位，哎，多远就可以不干扰这个正常的神经活动了呢？哎，等等等等，这些关于损伤部位的距离分析呢，被称为这个梯度分析啊。这一篇啊，哎，是梯度分析的，哎，另外一种事例了。这篇文章呢，我给大家放在这儿了啊，他发在了看cell这一篇啊，主要是以肿瘤为背景。大家都知道啊，肿瘤发生的时候。哎，它的局部会呈现出缺氧对吧，或者说血管生成的一个状态，如果一直是这样一个状态，那么肿瘤细胞它受不了这个微环境之后，它会自行就死掉了。对吧，就像这个图演示的一样，如果说哎缺氧和这个血管生成，哎这两个因素呢，限制了肿瘤细胞的发展，那么肿瘤就不会有那种大的，大的这个不停的复制自己，哎形成大的肿瘤块儿等等等等。

那么必然呢？有一些肿瘤。产生了逃逸。哎，产生了逃逸，产生了逃逸之后呢，它会脱离这个环境，或者说适应这个环境去到别的部位，然后呢，产生更多的，哎，复制自己能够适应环境的这样一种肿瘤细胞。从而形成一种独特的意志性。哎，这个图呢，简单的来讲就是说通过这个环境筛选之后啊，能够适应环境的地方，它会迅速的迁移到，哎迅速的迁移到哪，哎新的环境中，哎更加适宜的环境中，这个地方啊会有很多的一样，哎很多的内部的一些转变。很多内部的一些转变，比如说哎表观发生变化，哎，CV发生变化，突变，哎也有发生变化等等等等，通过改变自身适应这个，缺氧适应这个。嗯，血管生成，哎，缺乏的这样一种环境，哎，从而去到其他部位，这个时候呢，细胞就会从一个不太喜欢的地方。

哎，不太，这个叫这个。哎，环境比较恶劣的地方，慢慢的，哎来到他。觉得哎，环境比较好的地方。那么通过分析的程度来讲呢，就分析到这样一个层级了。哎，基因的哎，细胞的一个沉积，从一个区域哎慢慢的聚集到另一个区域，呈现出朝中心聚集或者朝中心扩散的一个趋势。哎，大家看这个右边这个图啊，两个区域之间必然有一定的迁移，对吧，如果说细胞为了更好的适应自己的环境，必然有一定的迁移，那么这种迁移的过程啊。哎，就受环境所影响了，大家可以看到这个。细胞的，哎，细胞等级gradient，哎细胞的这个层级，细胞的层级呢，大家可以看到它迁移的方向。是从这个地方，哎往外走对吧，往外走，哎箭头的方向往外走，说明这个细胞。

对这种，哎缺氧啊，对这种这个血管生，呃，血层不足啊，这种环境产生了这种。耐受性，哎，他为了脱离这个环境，开始往外转移。哎，对于这种真正的特征呢，大家可以看到，哎，缺氧的特征呢，缺氧的特征反而是从外围向内部的一个聚集，大家可以看到。嗯。箭头是朝内的，也就是说越往内越往内哎，缺氧的效应越大。对吧，越往内越缺氧啊，越环境越恶劣啊，如果说细胞没有这种能够适应恶劣环境并且迁移的能力，哎，这种种类细胞就在里面死在里面了。对吧，但是细胞正是因为获得了这种能力。哎，从而实现了从这个恶劣环境中向外迁移。而这部分肿瘤细胞啊，它就会体现一定的这个肿瘤迁移的一个基因进入的一个问题。哎，这就是关于空间，哎，轨迹上。的一些发哎的一些，哎，分析到的内容。

大家可以明显感觉到，细胞啊，为了逃离这样恶劣的环境，它会逐渐的过度，过度来到一个他比较喜欢的环境，从而像这种恶劣的环境向外发散。哎，向外发散，而真正的这种缺氧的缺氧的一个howmark就是特征啊。它因为在哎，它因为啊肿瘤的快速扩增，哎这样的一个状态呢，是从外围向中心聚集。而中心具体的情况呢？它越重，越往中心缺氧的程度越高。对吧，缺氧的程度越高，那么越不利于细胞生存。哎。如果说细胞没有这种迁移或者往外转移的能力，或者说不能适应这样一个恶劣的环境，它必然会在这种恶劣的环境中死掉。啊，也不会引起肿瘤的大规模发生，哎，但是因为肿瘤获得了这种能力，哎，所以它迅速的往外迁移啊，迅速的往外迁移，这就是宫间的一个进因梯度，哎，随着这个梯度的变化呀。

细胞会产生不一样的一个生物学反应，包括这个通路上都会有一些不一样的这个生物学反应啊。然后呢，这个就是下面的一个简单的打分事例了啊。哎，各种的豪马，它的一个从。哎，分数低的，哎，像分数高的一个聚集的程度，包括细胞类型转移的一个程度啊这个地方，这个区域该如何选呢。区域是如何选择的呢？比如说我怎么知道这个地方应该分析它的一个基因梯度，哎，这个地方应该分析它通路的梯度呢？哎，这个地方选择的时候啊，选择什么。就是选择肿瘤和那个，哎，肿瘤和这个正常的一个组织啊，它这个交界区作为他一个选择，看看肿瘤是向正常的扩散，还是直接就哎死在这个肿瘤内部了。哎，这是一个选择的方式啊。这篇文章呢，大家可以看到，哎，也是一样的道理，随着这个。

哎，随着这个空间部位的不同啊。它的一个基因梯度，哎，有一些变化，比如说这个。比如说这个啊，这边是肿瘤。哎，这边是Le，就是边界，哎，这边是这边是这个T，哎，临近的边界，这边呢，是纯正的normal区域，那么这三种区域啊。他们在环境上必然有一些很大的一个不同，对吧，必然有一些很大的不同，那么肿瘤细胞为了清洗，呃，正常的环境，或者说正常或者说哎，正常的环境，为了这个应对，哎，肿瘤细胞的清洗，它必然在基因的层面上会有一些梯度的变化。哎，会有一些梯度的变化，那么这里面呢，有一个，哎，他用这个spata two分析的这样一种基因，基因转变的一个可能，哎随着基因转变的一个可能，转变之后呢，他通过分析呢，就会发现从肿瘤哎到这个交换区就是这个。

呃，临近，呃，就是过渡区域，过渡的一个状态，哎，慢慢的到这个，哎，正常的一个区域，那么从这个方向上来看呢，哎，随着这三个区域。它基因梯度的一个不同，哎，大家可以看明显感觉到这种哎趋势的一个变化。对吧，大家可以看到，哎，这是轨迹的方向，哎，基因梯度的一个方向，哎，基因图的一个方向，然后是用帕塔来分析它的一个空间轨迹的一个预测。然后注释的时候呢，红色。是什么？肿瘤区对吧，它表达一定的基因特征，哎，它表达一定的基因特征，这个特征呢，大家可以看一看，和这个绿色，绿色是这个T啊，就是交界区，就是说过渡态的这样一个特征，哎，它表达具有重叠的地方。它表达具有重叠的地方，对吧，就是说肿瘤区域表达的基因，哎，在空间转移的过程中呢，也来到了这个交界区域。而正常区域的，而正常区域表达的基因啊，纯正的肿瘤细胞是不表达的。

对吧，这个地方是不表达的。但是呢，这个过渡态就是这个地方，哎，它又表达正常的一些基因。它要表达正常的一些基因，哎，那么在过，那么在这个研究的过程中啊，就会发现，哎，整体的一个侵入过程呢，就是肿瘤，哎，肿瘤慢慢过渡到这个正常区，这个正常区域具有肿瘤的特征。哎，也有这个正常区域的一个基因表达的一个特征，哎，那么随着这样的一个时间推移呢，慢慢的这个清晰化。哎，认识到这个区域了之后呢，就把它，哎慢慢的肿瘤就会迁移到，就会侵入正常区域，形成一个大的肿瘤块儿等等。哎，那么在这个整个的过程中啊，基因剔度的过程中啊，有一些基因啊是非常重要的，哎，具有肿瘤转移性，呃，迁移转移性的有一些是什么。哎，有一些是抑制的。

但是从整体情况来看，它具有清晰性，自然是有一些基因在推动整个的一个过程的一个运转。哎，通过这样的一个推断呢，哎，Spta two, 哎空间轨迹的这样一个推断，哎，推断这个肿瘤的清晰性。哎，从这个肿瘤核心区朝这个normal区域来。呃，演化。哎，推断这个肿瘤科去，哎呀。哎，大家可以看到推断这个肿瘤区域的时候啊，研究这个空间在这个基因表达层级的一个变化啊，哎，很明显存在这种，哎，很明显存在这种，哎，交界区域。哎，就是说大家的特征都有一点，都有一点啊。但是呢，有的时候呢，他会把它标注出来。这个地方。哎，这个地方呢，大家可以看到，虽然在肿瘤内部也有一些表达，但是表达不是很高，没有像这个固度态很高。对吧，像这个地方呢，哎，这些表达都会比较接近了，比较接近了，那么这个区域。这部分记忆。

哎，就是一些关键性的基因了。这些基因很可能就是促进肿瘤转移的一些关键性基因啊，这些基因将会成为下游研究的一个重点啊。啊，这张图呢，简单的给大家补充一个前面的一个分析啊，前面在讲这个空间CV的时候啊，讲到过一点说。呃，空间做空，呃，这个CV呢，呃是为了研究肿瘤内部的一致性。哎，但是在这篇文章里面啊，就是这篇文章他提到一个点，提到一个点是什么呢。他为了验证这个组织是正常的区域。哎，他为了验证这个组织是正常的区域啊，它也做了一个CUV，然后CV，大家可以看到几乎是白板的存在，就是没有CV事件，以此来证明，哎，证明什么？证明它这个组织是正常的一个组织。哎，这是一个比较哎另类的做法啊，比较少见的做法，哎，大家可以借鉴一下啊，如果将来如果遇到这个正常样本，怀疑他有CV的时候，尤其是什么呢。

尤其是在研究癌鹏的时候。癌旁大家都知道，随着癌旁和肿瘤交界的地方啊，通常虽然说是正常的一个细胞，但是已经是哎，显现出一些CV事件了，是CV的早期事件。那么我如果想用正常的一个先研究真正的一个Apple，哎，就可以通过这种方式来分析一下，告诉说这个Apple是真正的，哎，没有收到这个肿瘤清洗的Apple。以它作为起点研究，哎，包括空间基因开关啊，空间的一个轨迹啊等等等等，哎，这是比较合理的做法啊，那么下面这张图呢，大家可以看到。上面提到啊，关于空，哎，关于这个肿瘤的一个什么。基因梯度的一个问题啊，随着基因的一个转移，哎，它的表达存在一定的梯度。哎，那么真实的一个情况是什么呢？真实的一个情况就像上面这个一样，它的根本上的原因还是由于它获得了一些突变信息或者CV信息，影响了它的表观。

哎，那么在空间转录组讲，前面也提到过，空间上是可以做基因突变信息的，那么从这个基因突变的频率上来看，哎，呈现出怎样一个状态呢？大家可以看到。这个关键基因哪来的？就是在分析基因梯度的时候，从这来的。啊，这些基因非常关键，他把它拿出来了，同时呢，也做，也做了一个关于空间这个拷贝数变异的一个，哎，不是拷贝数变异，就是基因突变的一个内容。哎，通过做这个基因突变的内容呢，哎，第一节课讲过啊，单细胞在一定范围内是可以做这个基因突变的，哎，大家可以看到这个基因突变的频率啊，由低到高呈现出这样一个状态。哎，呈现出一个怎样的状态。这个地方大家看到没？通过CV分析，哎，零星有一些对吧，零星有一些，那么从突变的一个角度来看，哎，大家可以看到突变的分布啊。0是白色，白色是没有突变的，哎，红色越红突变率越高，大家可以看到这个样本，哎，外围已经产生明显的一个突变信息了。

哎，这边也是一样的啊，随着这个这是不同的样本，哎，不同的样本它在这个图片上，哎，就会呈现出不一样的一个状态。那么从这个基因表达这个层面，结合这个基因突变的一个层面，就可以表征出到底怎么，到底这个基因表达变化，哎，是受什么影响？一方面表达变化会受微环境影响。另一方面，肿瘤会拥有这个强有强大的这个突变能力，随机突变的能力，那么这种突变呢，对基因表达也是会有这种哎，至关重要的影响啊。哎，这个就是。简单的示意图了啊。这个一哪个1。哪个1。哪有1啊？这个。这个一吗。

右上角。1走了。啊，这是CV图啊CV图。CV的处方。大家可以看啊，这个图呢，就不多解释了啊，之前在CV上已经哎解释过了，大家在分析的时候呢，对它一个肿瘤抑制性要有一个初步的判断啊。这个呢，就是简单的一个，哎，在分析呃，基因变化的时候的一个梯度啊，也叫基因轨迹的一个内容，很多时候啊，简单的分析是指什么，就是指这个肿瘤啊，随着距离的变化，诶，来到这个交界区，它的一个诶，无论是基因的变化，还是细胞类型的变化等等等等啊，这个时候大家要注意啊，不能采用类似于MONCO2那种舒适方法。猫饭哪个地方啊？Modified expression修饰后的表达吗C吗？这个在CV已经讲过了，还要再讲一遍吗？我们就过了啊。

然后是这个关于轨迹，哎，空间轨迹和空间基因力度就是随着距不同部位的一个变化。它的一个呃，基因的表达上呈现出一定的不一样的一个梯度关系。哎，右边这个图呢，简单的就是呈现了这样基因梯度。随着距离，它的聚集程度和哎，疏散程度等等等等，以此来判断啊，这个基因的一个行为特征。哎，这就是关于空间基因梯度在这个实际应用中的一个内容啊，实际应用中的一个内容，哎，那么我们真正在分析的时候，哎，真正在分析的时候，这个地方给大家做了一个非常详细的解释啊，就是说肿瘤组织包含抑制性的细胞区，哎这个就不要，这个大家都已经形成共识了啊，如果说肿瘤程度很高。对吧，那么对于下游的治疗来讲非常的友好，哎，治疗的效果，治疗的这个治疗的效果会非常好，因为没有抑制性，但是正是因为肿瘤内部存在很强的抑制性啊。

所以治疗一个之后，可能比如说肿瘤细胞分了5个群，你治疗其中的一个群啊，另外4个群就获得了生长优势了，这个时候肿瘤就会继续的复发，继续的变大。哎，从而造成更加严重的后果。啊，那么在这个哎，每个肿瘤亚群啊，它因为哎包含抑制性，所以它的微环境啊，或多或少都有一些差异，包括它的突变，包括它的遗传方面，哎，表观等等都有一些不一样的地方。哎，那么为了研究这个。多因素哎，肿瘤内部的一个特征，包括它的一个突变啊，转移啊，治疗的一个耐受性啊等等的一个原因呢。哎，其中，哎，我在之前分享过一篇文章啊，其中一方面是自身突变对吧，那么另一个方面呢，主要就是微环境。哎，微玩具通过不同的一个方式塑造基因表达。啊，也就是说为了适应这个环境，塑造这个基因表达，比如说前面刚才讲到的那个缺氧。哎，和这个血管生成方面的一个基因。

哎，其中呢，主要的是包括这个，哎，细胞间通讯，或者说局部信号提示株，刚才提到的缺氧啊，PH值啊等等这样一些变化，影响到基因的表达。哎，所以说呢，一些细胞会随着他们的空间定位而表现出渐变的转录变异。这被称为空间基因梯度啊，这是对基因梯度下的一个定义，明白吧，正是因为空间的不同，导致了一些细胞哎，随着空间定位啊，表现出渐变，就是说有一些基因表达上的一个变化，随着距离的远近，呈现出一种梯度分布。哎，这就是空间基因梯度了。而我们做这个分析呢，主要的一个实现目标就是为了检测哎，空间基因推度的存在和方向性。哎，我们这里面呢，空间机梯度啊，在去年讲课的时候，哎，专门讲过一节什么呢，专门讲过一节关于这个空间。轨迹向量场的内容，哎，它和这个空间梯度啊非常相似，空间轨迹向量场就是为了实现这个结果。

哎，通路的聚集性或者通路的发散性，细胞的聚集性或细胞的发散性，哎，去年呃，专门讲了一课，哎，实践方法呢，基本上都哎为0公开化了啊，大家感兴趣可以回头看一看。那么通过我们今天的这个未来分析这个空间基因梯度啊，需要从这个基因表达出，哎，获得这个基因表型就是细胞的可解释的表型，也就是哎，有人在群里发的，哎，我可不可以用一固定的基因级来分析这个空间基因梯度？哎，是可以的啊，是可以的，只不过呀。我们通常搜集到的那些基因啊，就像前面提到的这种受损伤基因。损伤基因对吧，我也会收集到一些损伤基因，或者其他各种各样的基因，或者转移基因等等，这个基因啊要被哎，要被作为什么呢。哎，可指示可解释的细胞表型。也就是说大家收集到的这些基因啊，要能够可解释，比如说都是缺氧通路的，必须都是这个什么通路的损伤的，基因的变化等等等等，这些基因啊，要有一定的来源，如果我们没有这样的来源，没有固定的一个来源的话，哎，单细胞和空间课上都讲过NMF这个方法，它是用来寻找什么？

哎，寻找这个program就是分子程序。哎，它的一个解释，解释性啊，就比这个PCA要高得多，它所寻找到的一些基因啊，都是一些哎，相关性非常强的基因，这些基因正是，哎，就是说在没有这个显眼的知识情况下找到的一些基因，基因它可以一定程度上代表我们的细胞表型。啊。然后呢，同时检测每一个生态C，哎，生态位中位线空间梯度的存在和方向啊。其中啊，它这个生态位是什么呢？哎，前面讲到过，生态位就是不同的空间区域对吧，那么空间区域，不同的空间区域之间因为环境的不同，哎，自然而然会随着什么。

一些细胞会随着基因空间定位的表表现而出现出渐变的转物变异，哎，和这个结合起来，生态位置主微环境，哎，也就是空间定位。生态位的不同，也就是空间位，空间定位上存在差异，哎，空间定位上存在差异的话，细胞会在它，哎不同的空间定位上，哎，表现出它转入的一个变异。哎，就像这样的一个变化。啊。哎，随着之间的变异啊，它会呈现出一定的空间表达的一个变化，而我们所要研究的时候，就是空间的这个梯度有少向多的一个方向性，其中呢。哎。有一些问题需要大家考虑，就是gradient这个梯度啊。在这个淋浴的过程中。是这个是否存在，首先是否存在对吧，如果存在的话，哎，方向性如何。它是朝向哪个方向的？从这个负极到从这个负极到哎，从它一个聚集的程度到它一个发散的程度，它的是它在向哪个地方聚集还是发散，这是它的方向性问题，最后还有一个可解释性。

哎，可解是这样，就像这个一样。肿瘤细胞在扩散，对吧，发生到其他部位，而这种缺氧的一个缺氧的一个通络呢，却在朝中心负集，哎，那么它有一个这对肿瘤的一个可解释性，就是其生物学意义。哎，也是一个非常重要的方面。哎，这是它的一个研究的一个算法啊，研究的一个算法。哎，空中process of differentredis啊，然后呢，空间的这个不同的这个肿瘤梯度啊，大家可以看到，哎，基本上都是在研究。他朝着它更高层级的一个方向，负极的一个方向。啊，这些方向性，当然在比如说缺氧的腹肌，那肿瘤就扩扩散等等这样一种方向性啊。哎，正是我们今天所要讲的一个重点内容。

啊。这是一个哎，简单的一个哎，定义啊定义，前面的定义啊讲过了，今天我们在我们不仅要会这个内容，哎，也要懂得它在生物学上的一个应用。这里面呢，细胞解剖结构和信号传导在不同的生态位有所不同，这个已经强调过很多次了啊，所以说大家在研究空间上的时候，哎，空间固定位。空间领域。进行梯度。还有一些这个，呃，关于这个。呃，包括通讯啊，淋浴通讯啊，信号流啊等等，这都是分析上的一个重点。哎，这个可以在细胞亚群中诱导渐变的基因表达。这种空间基因梯度是肿瘤意识性的来源，哎，可以影响肿瘤侵袭进展和治疗的一个反应啊，这种空间基因梯度啊，更多的是从更多的是研究这个基因，哎，无论是基因基因还是细胞的一个方向性问题啊，这里面呢，需要回答这三个问题。

哎，空间低音梯度的一个位置。哎，首先有没有这种梯度啊，梯度在哪儿对吧？第二个呢，方向性是朝内啊还是朝外啊，哎，生物学功能，这个生物学功能主要是什么。哎，收集到的这些基因到底在干什么？到底在干什么，比如说T，比如说损伤，它有一定的梯度，他如果说正常的损伤来讲，他应该梯度是哎。正常的区域啊，是没有这种梯度的基因梯度的，哎，损伤部位呢，是这个梯度的中心，哎，那么有这种梯度的地方就是这个损伤的起点，哎，它影响的最大范围。哎，右边这个图呢，就简单的解释了这个空间基因梯度的来实现的方法，哎，首先呢，为了实现不要用NMF把所有的数据中的表达，哎，分成了多个因子，每个因子呢，就包含了一定具有协同效应，具有可解释性的一个基因基，如果大家在之前在做单细胞的一个分析的过程中啊。

哎，尤其在PC的过程中，哎，可能看过一些推文说NMF可以取代PC。哎，结卷积，哎，分析得到的这个因子啊，具有更高的一个可解释性。哎，这个软这个地方呢，就借鉴了这个NMF这个方法，包括这个NM方法，在这个寻找基因program程序。大家看过一些高分文件的话，应该很多文章都有这个NMF来识别这个程序program，这些program都具有很强的一个生物学可解读性，哎，所以高分文家一般都很喜欢用这个方法。哎，这里面就包括了细胞的组成和调节细胞表型，调节细胞表现是什么，就是基因。哎，细胞组成呢，就是细胞的成分。哎，通过进一步计算，细胞loading和基因loading分别表明program program就是因子，哎，在细胞和水平上。哎。在细胞呃和sport水平上的活性和program的基因水平上的一个属性，其实就是为了研究这些基因的一个方向性和生物学意义。

哎，这个就是简单的，大家一个示意图，大家可以看一看啊。哎，研究细胞梯度的时候就是这样的。哎，细胞的一个比例，对手，哎，它朝哪个方向进行一个聚集。哎，这个也是一样的啊，聚集聚集。好了，这就是基因梯度啊，这里面强调一点的是什么呢？关于基因梯度啊，在文献中的应用啊，目前还比较少。哎，我列的两篇文件呢，一篇运用了这个PAR。哎，这个空间轨，这个空间基因梯度类似于单细胞的空间轨迹，只不过这个轨迹啊。不像单细胞那样是表征发育的。是表示什么清袭的，就是说肿瘤向这个正常，哎，从边界向正常转移的时候，它这个侵袭性的基因表达的一个变化。哎，表中它的清晰性的，你像这个。第二个文章呢。

它在这个表征空间基因梯度的时候是表征什么？哎，细胞类型的聚集性，或者说通路的聚集性的。这样的话，在分析的过程中啊，我们就要分析细胞类型，是否向中心聚集，还是具有发散。而通路具有细胞聚集还是发散，这样的话，在多样本比较的情况下，就可以判断出这个肿瘤细胞体在，哎，它是一一开始存在于怎样的一个环境中。而他的生物学表现是什么？哎，比如说这个它处在这个缺氧环境中，它的生物学表现就是逃离这里。这就是我们关于空间基因梯度啊，在文章中的一个实际的运用，哎，那么随着这个。空间转录组文章的一个慢慢的一个研究变多呀，关于空间机构的问题啊，也慢慢成为一个分析上的一个常规售后了。哎，所以说呢，很多人都开始研究这个不同的生态位之间，他们基因梯度的一个变化。等等等等。啊好，我们休息5分钟，休息5分钟，我们来看看我们的代码部分，好吧，休息5分钟啊。

哎，这里面大家要注意啊，大家要注意空间基因梯度体现的是什么，大家抓住核心的一点就行了，空间基因梯度体现的是细胞的行为或者基因的行为。哎，也就是说在这种环境中，细胞呈现出怎样的一个什么行为，就是它远离这个环境还是来到这个环境啊，这是空间基因梯度所要研究的一个主要内容，包括基因的梯度是什么，这个基因也是代表的生物学的一个意义，这种生物学特性，它是朝着哎什么样的一个方向发展。

明白吧，比如说都是侵袭性的基因，哎，他在朝着什么样的方向发展等等等等啊。这就是空间基因梯度啊，大家抓住这个核心就可以了啊，分析的过程中呢。啊，不过目前来讲，客户对这个空间经营梯度啊认识不足。呃，分析的很少啊，包括这种梯度。随着部位不同，从肿瘤到边界这样的一个梯度的一个变化。哎，包括这种梯度啊。哎，目前来讲空间分析的都比较少，为什么。哎，对他的认识性不足啊，认识性不足。还有一个是什么呢？还有一个就是说。这个地方和当初的那个讲到那个空间基因开关就是在。空间转录组，呃，过那个个性化分析的时候，对那个空间进行开关啊。哎，很相似。这个地方交界处必然屏蔽了一定的生物学信号，也必然保留了一些生物学信号，哎，造成了内外环境的一个巨大差异。

这个时候呢，基因梯度就会发生变化，哎，无论是通路梯度，基因梯度都会发生变化。明白吧？哎，大家抓住核心一点啊，就是来体现。基因梯度用什么衡量？衡量是什么意思？基因梯度就是说基因的一个行为啊。哎，这里面不是给大家说到了吗？如果说基因梯度的话，就是这样一个行为。哎，通过NMF把这个。那把基因啊，分解成可解释的一个基因基，这个基因集呢？哎，它包含的就是生物细胞组成和细胞表型。哎，我们这个地方呢，拿到这个基因级之后啊，就要来体现它的一个。哎，生物学行为就像这个地方一样。他的生物学行为，它是朝哪个方向发展，哎，他是朝哪个。哎，他的生物学行为是什么？回答的是这3个问题。方向性和生物学功能，哎，这是后面最最重要的两个啊。

至于你说的这个衡量标准是什么意思？衡量单位是什么？单位是什么单位积级吗？你知道这个。阶级或者细胞级吗？好了，我们来看看我们的代码部分啊。看看我们的代码部分啊。这个。代码部分啊，大家有些包啊，特别难装，大家需要点耐心啊。其中男装的包是哪个呢？就这个。Magick这个包特别难装，特别难装，大家装的时候要稍微诶小心一点，哎，用点耐心，很多包啊装大家装，如果装包装多了之后啊，就会发现有些包啊，它依赖的环境非常的一个麻烦。

为了构建这样一个环境呢，特别的，哎，麻烦。哎，大家大家一定要耐心，如果把那些很难装的包大家自己都能装上的话，哎，基本上大家这个搭建环境的能力应该是没有问题了啊。R里面用的4还是4和5都可以啊。都可以。现在慢慢的呀，现在慢慢的是什么。现在慢慢的那个4慢慢都转向5了啊，包括公司内部也都开始慢慢的转向5了，5和4最大的区别是什么。哎，就是多了不同的layer，哎层这个层，其实这个layers啊，在Python版本的研究中已经是非常常见的一个内容，明白吧，非常常见了。其实呢，就是多了一个什么。哎，多了一个你@的对象啊，就是AA。哎，但是呢，因为很多之前的分析软件。

嗯，上课的代码，上课代码4和5都可以，不过我这边用的是5啊。啊，这个地方大家不能太纠结于4和5啊，4和5大家都要会啊，以后慢慢都会转向5的啊。大家看我这个三二这个版本。啊，这是R版本。有没有写的版本？没有写，我们看一下啊。是这个吧。哎呀，没有这个。看版本那个函数有点忘了啊。哦，是这个。

啊，我这里应该是我应该是我啊。这是大厦的函数啊，我很多很久不看这个R版本了。我现在，哎。函数都不能用是吗？哎，我这里边也用的是5啊，用的是5啊。4和5最大的区别是什么？最大的区别是什么？哎，多了这个layers。多了这个layers看到了没？其实这个例子啊，就相当于之前的那个什么。大家@的那个对象啊。就是啊C啊C里面放的是什么什么矩阵把它放在这里面了，只不过呢，现在呢。哎。呃，12的版本呢，为了区分这个多组学，大家都知道现在朝着多组学方向发展了是吧？有空间数据，有单细胞数据，有a tag数据，有各种各样的数据，这个时候就放不在这个A的下面了。

IC下面只能放一个一个主学的数据，比如说只能放这个单细胞的，哎，Count数据，Normalize的数据和skill的数据，只能放一个主学的数据，那么如果我们朝多组学方向发展的话，我们想放这个空间数据。想放这个。APEC数据想放VB的数据怎么办呢？哎，所以说熟更新到了我，哎就是为了防止这个事情的发生啊，为了这为了这个多助学员做准做的准备这个lay。明白吧？哎，接下来呢，就是我们常见的NMF找这个program了。这里面定义了2个函数啊，这个2个函数呢，大家回头可以看看。大家可以看到，基本上如果我们简单的只有这个RNA数据。RNA数据，就是说我们只有这个RNA的数据，哎，它的一个放的位置啊。

和我们原来4的取法是差不多的。哎，是的，取码是差不多的啊。这个地方呢，还有一个需要值得的，值得注意的地方，就是可以放多个样本，单独的一个矩阵。而这个地方如果普通的那种4啊，这个地方放的是什么多样的联合的矩阵对吧，联合在一起的矩阵，现在有了lay的之后啊，可以放单独的矩阵了，它是为了保更保留更多的一个原始信息啊，保留更多的一个原始信息，方便信息的调取，而不是扭曲后的信息啊。接下来呢，就是这个寻找NMF了。NMF, 哎，前面提到过，一般在单细胞或者空间上用NMF方法是来干嘛的？寻找具有可解读性的一个program。哎，这个program通常是基因级。而我们这里面就需要借助这种方法识别这个可解释的基因。基。哎，来判断他的一个空间行为，它的梯度是是朝着怎样的一个方向发展。

好。这个过程啊，稍微有一点，哎，耗时比较长一点，而且需要的资源会多一点，大家在跑的时候啊，尽量不要用这个。还是那句话，尽量不要用自己的电脑，用这个什么。哎，用服务器啊，用服务器。哎，我们稍微等他一下，这地方会稍微。时间会长一点啊。Layers啊。Comes special special, 哎，这是它的一个基础注释信息啊。啊，其实这个LIS在呃，产生这个LIS之后啊。啊，可能对大家分析产生了一定的困扰，因为很多包啊，很多开发的方法都是基于4或者3的，哎，突然来到我不兼容了，这也是很大的一个麻烦，所以说大家要会学会相互转换，相互转换，转换的意义不是说一定要有4的结构或者5的结构，而是要同时含有4和5的结构。

明白吧，就是说这里面的地方是能取到的数据依然能取到。4里放在这儿，哎，4还保留了它的一个结构母呢。哎，5这个地方lays就放每个样本的数据，或者多组学的数据。哎，这样的话既能兼容4版本开发的软件，又能在我的基础上开发督促学。哎，大家要灵活会用啊，现在公司啊，慢慢的都在慢慢的干嘛，都在升级了。啊，以后都会慢慢升级到5的，不会再用啊，4当然也会用啊。哎，当然也会用。哎，但是呢。哎，他毕竟会慢慢的被这个新的一个方法所取代啊。新的方法也取代。哎，我们首先看，看来最后1。第一张图啊。

嗯。大家看这个NMF图有没有，哎，很有感觉啊，那寻找program的时候，之前强调过这个program。有时候是需要什么，需要我们人为的指定它到底用几。哎，用挤，大家看这个是不是很像这个PCA的图。细胞通讯怎么都升级了？那3个包分析数据和旧版本有什么区别？你是指单细胞吗？还是空间啊。单细胞是吧，单细胞的c DB cell trade ni net, 它升级了，它底层算法并没有变啊，只是多了一些验证这个单细胞通讯的一个证据，哎，让它的结果更加的可靠了，像三三分DB。哎，从一个纯的Python代码，它变成了一个Python模块，对吧，分析方法参数都没有变。直接分析就可以了，CT并没有升级CT的VR，只是升级了空间的一个同学啊，不过那个用的很少。

哎，Ni net包括multi ni net, 哎这个比较推荐大家用啊，还考虑了多矩阵多信息来源，准确性相对较高，但是还是和单细胞过单细呃过个性化分析的那个方法一样。哎，大家如果冲击高分20分以上30分以上的时候，通常需要多软多软件联合使用。啊，那个思路大家可以回头再看一看啊。哎，这个就是NMF寻找到的这个类似于PC的那种税试图有的时候呢，我们在前面讲到过NMF为了寻找这个具有生物学意义的program，需要我们人为的干嘛指定一个参数。哎，到底有几个program？哎，怎么来呢，就得这样的来了。哎，也是拐点处作为它的一个很明显的一个，哎，边界点。哎，边界点啊。

好了，我们继续往下啊，继续往下啊，接下来就是什么。找这个program了，这里面啊，这个K就是我们需要人为指定的。这个K就需要人为指定了，刚才看那个税时图大概呃10已经超过这个拐点了。啊，我这里是演示数据啊，所以不是那么的合适啊，不是那么的合适，真正的program我应该是这个拐点处。这大概就是34的样子是吧，我这个样本就单个样本啊，数据量比较少，所以他在寻找生物生物学可解读的这个program的时候啊，偏少一点啊，偏少一点，真正的一个曲线会稍微的多一点啊，一般在10左右啊五六也有可能。哎，这个地方就需要人为来指定了，需要看的个图来看，哎，我们到底要哎分析判断有多少个program，哎，作为它的一个猪肉。哎，接下来呢，拿到空间坐标。哎，空间坐标呢，也是一样的，空间坐标4和5啊，SP4和5，它放的位置都是一样的啊，放的位置都是一样的。

接下来就计算这个neighbor了。嗯。哎，一样的道理，一样的道理啊，这个地方有一个问题是什么呢？这个Nce per大家会指定吗？哎，前面强调过领域是6啊，V字么是6，那个高精度是10，那么这个地方该指定多少呢？就是它它的方向性分析基因梯度的时候，哎，这个梯度的，哎，就是说我和周围的差异多大算范围呢？多大的范围呢？哎，这个时候就要写的远一点了，远一点，比如说它的一个。哎，比如说它的我的我的我为了分析基力度，我以两层为这个一个梯度，哎，分析它的一个变化等等等等，就要稍微写的大一点啊。

好，那写完了。哎，分析完了之后干嘛每个NMF，哎，前面提到了每个program是可解释的，哎，可解释的是怎么解释的呢？哎，这里面采用了这个负极的方法。哎，复习的方法。把每个呃，Program它的一个生物学意义啊，进行一个注释，哎，注释拿着这个显著的一个位点。哎，就是拿到这个显著的位点啊，这边绘图就不绘了啊，大家回去会吧，我们最主要的是拿到最后这张图。就是他的一个刚才PPT讲到的一个是否存在基因梯度。是否存在基因梯度？梯度的方向性以及梯度的生物学意义，前面的过程呢，哎，主要是对这个生物学意义进行注释，这个地方呢，就是要绘制这个梯度的方向性，以及它是否存在的这样一个内容。好，我们来画一下。

300。哎，我们来画一下啊。好。画出来就是这种效果了啊。画出来就是这种效果了。当然啊，每个NMF代表了不同的一个生物学意义，生物学状态，前面PPT也提到过了，哎。一些细胞会随着它们的空间定位而表现出渐变的转录变异，哎，这个时候被称为空间转录，哎，空间转录度梯度也叫基因梯度，这个时候呢，大家应该看到这个图的一个变化。什么变化？哎，如果说这是一个。哎，宋太尉的话。哎，这个也是生态位的话，这个是肿瘤区域，对吧，肿瘤区域。

哎，这个是什么区域。这个是一个，哎，也是一个特殊区域，这个是健康区域，大家可以明显感觉到是什么。它的基因梯度变化会随着会沿着边界形成这样一种。哎，指向性。我们以这个肿瘤为例，你看它每个梯度呢，都会形成一个指向性的一个内容，像绿色呢，都是朝内，也就是说这个时候呢，基因会朝内部负极。而这种这种颜色呢，是朝外的，呃，明显的随着这个边界啊，会呈现两种的一个生物学状态。哎，明显呈现出两种生物学状态，这两种生物学状态代表了怎样的一个生物学意义，以及它的一个扩散的一个方向性。成为我们，哎空间基因梯度研究的一个热点了哈，一个热点。有，还有这种区域也是一样的。沿着边界，哎，这种深蓝色的朝内。哎，深蓝色的朝内，这种颜色呢，朝外。朝外对吧，形成了这种很很具有这个鲜明的一个梯度的关系，哎，它的方向性啊，和这个梯度啊，都有一个明显的差异性。

哎，那么对于这种生物学行为，到底诶是什么原因导致的，以及它内部的一个深层次的机理，将会成为下游研究的一个热点啊，一个热点。这就是基因梯度了。哎，如果说我们用这种脑损伤的话。哎，这明显的梯度就是朝向这样了。哎，脑损伤的呢，我这边昨天也跑了一个啊。哎，当然这个没有损伤啊，只不过是呈啊呈现出这样的这种状态。大家可以明显的把这个放大，可以看看是什么，这是海马区对吧。这个是海马区。哎，不同的区域呢，哎，基因梯度呈现出一种相反的一个模式啊，每个梯度呢，会有一种什么固定的生物学意，哎，其实生物学意向外聚集的方式。或者向内聚集的方式，哎，它的一个方向性，以可解读的生物学义，哎，将会是研究的一个重点啊，重点当然这里比较乱啊，有的时候我们哎不话那么多，哎不话那么多。

哎，有的时候就画一个就可以了。Plot.我们画一个啊，画一个看看。哪儿去了甘肃？我们来看一下这个函数，如果我们只画一个其中的一个的话。

哎，我们起个新的名字2。哎，我们只画其中的一个啊。看看他的一个状态。哎，有时候多了我们可能看不出来，哎，我们把它单独的绘制一下看一看。啊，像这种。这个颜色可能不太明显啊。我们来看看有没有其他颜色。3。

好。哎，来看看它的一个变化哦，都是这种颜色啊。颜色能不能指定啊，我看一下啊，应该可以吧。那最小的发给的是20。那好像没有指定颜色，这个是吗？啊，写的时候没有指定颜色，看看能不能画2种啊。好。

哎，接着我明显的感觉到啊，当然这个梯度啊，好像是一致的梯度啊。哎，我们想拿到的是这种啊，我们看一下这个所有的。一啊一和。1和10哎，是相反的梯度。绿色和红色基本上也是相反的。绿色是3。红色是5啊，我们来画一下3后5。哎，看这种变化啊，这种明显就能感觉到它这个梯度的一个变化了，哎在这个范围内，哎在这个范围内，哎这个区域呢，像这种正常区域呈现这样朝现出这样一个梯度的方向。

哎，这个区域呢，在肿瘤边界上，这个绿色呢，就这个5啊，哎，会朝向正常区域，也就是说像正常区域的一个负极的一个方向。而这种诶3呢，就会呈现出向肿瘤转移的一个方向啊，呈现出明显的一种交界的一个态势，哎，这种每个NMF代表其后的生物学意义，正是我们研究这种边界的一个很重要的一个点。啊，包括刚才提到的这种边界。也是一样的，哎，这种执行梯度呢，就是在不同的一个病，不同的一个范围啊。不同的一个生态位中，哎，不同的一个区域中，哎会展现出明显不同的一个梯度变化，你像这种的也是一样的，沿着这个边界呈现出明显的梯度变化，哎，说明哎就和刚才PPT讲到的那一样。哎。细胞类型在不同的一个环境中。哎，细胞类型在不同的环境中。哎，随着它的空间定位而表现出渐变的转动变异，哎，渐变的转变变异。

哎，渐变的一个变化，哎，基因通路的一个变化，哎，这就是。空间转录组，哎，梯度啊。好了，差不多这节课差不多就是这么多内容了，这个分析还是比较冷门的啊，不过一不过随着大家研究空间转入手，研究的越来越多呀，哎，这些冷门的分析可能也会慢慢变得比较热门啊。尤其是研究哎，肿瘤内部抑制性的时候，哎，这些梯度非常有用啊，这些地方肯定就是一个肿瘤梯度的一个编辑。还有肿瘤，那个基因的肿瘤意识性的一个边界啊。好了。