【百欧泰生物】单细胞全基因组测序：聚焦单细胞基因全貌

单细胞全基因组测序，是针对单个细胞开展的基因组测序技术。其优势显著，突破传统测序对大量细胞需求的局限，能深入分析单个细胞的遗传信息，揭示细胞间的异质性，避免群体细胞平均化掩盖关键信息。在科研和临床领域应用广泛，科研上助力发育生物学研究，了解胚胎发育中细胞分化路径；临床中用于肿瘤早期诊断，精准识别癌细胞独特基因组特征，为个性化治疗提供依据，在生命科学研究与医学实践中发挥着关键作用。

实验方法

1. 单细胞获取

流式细胞分选：将细胞悬液调整至合适浓度，一般为106-107个细胞/mL，通过流式细胞仪根据细胞的大小、粒度及表面标志物等特征进行单细胞分选，将目标单细胞分选到含有裂解液的PCR管中。

显微操作：在显微镜下，使用微吸管或激光捕获显微切割技术直接从组织切片或细胞群体中挑取单个细胞，放入特定的反应容器中。

2. 细胞裂解

加入裂解液：向含有单细胞的容器中加入适量裂解液10-20μL。裂解液包含蛋白酶K（终浓度为0.5-1 mg/mL）和去污剂（Triton X-100终浓度为0.1%-1%）。

孵育条件：在55-65℃条件下孵育30分钟至1小时，使细胞破裂并释放基因组DNA。

3. 全基因组扩增（WGA）

MDA方法：多重置换扩增（MDA），反应体系为50-100 μL。其中包含Phi29 DNA聚合酶（5-10 U）、随机引物（终浓度为1-5μM）、dNTP混合物（各200-500μM）等。在30-37℃下反应6-12小时，可将单细胞中的微量DNA扩增至微克级水平。

4. 文库构建

4.1 片段化：将扩增后的DNA进行片段化处理，可使用超声破碎仪将DNA片段大小控制在200-500 bp左右。或者采用酶切方法，如加入适量的限制性内切酶（1-5 U），在合适温度下反应1-2小时。

4.2 末端修复：反应体系一般为50μL，包含T4 DNA聚合酶（2-5 U）、Klenow片段（2-5 U）、dNTP混合物（各100-200μM）等，在16-25℃下反应30-60分钟，使DNA片段末端变为平端。

4.3 加A尾：向末端修复后的产物中加入Klenow片段（exo-）（2-5 U）和dATP（0.5-1 mM），在37℃下反应30-60分钟，在DNA片段的3'端加上一个A碱基。

4.4 接头连接：使用T4 DNA连接酶（10-20 U）将带有粘性末端的接头（终浓度为1-5μM）连接到加A尾后的DNA片段上，反应体系为50μL，在16℃下过夜连接。

5. 测序

质量检测与定量：采用琼脂糖凝胶电泳、荧光定量PCR等方法对文库进行质量检测和定量，确保文库质量合格且浓度准确。

上机测序：Illumina平台，按照其标准流程加入适量的文库DNA（2-10 pmol）进行测序。

6. 数据分析

数据预处理：去除低质量 reads、接头序列等，对数据进行质量控制。

比对与变异检测：将处理后的数据与参考基因组进行比对，使用生物信息学软件检测单核苷酸变异（SNV）、插入缺失变异（InDel）等。

结果解读：对检测到的变异进行注释和功能分析，结合生物学背景和研究目的，深入理解单细胞全基因组的特征和意义。

评估单细胞全基因组测序的实验结果质量

测序数据量

覆盖度：评估基因组被测序 reads覆盖的比例，一般要求覆盖度达到一定水平，如70%以上，以确保大部分基因组信息被获取。

测序深度：指平均每个碱基被测序的次数，足够的深度可保证准确检测到变异，一般单细胞全基因组测序深度在10X-30X左右。

数据质量

碱基质量值：通过测序平台给出的碱基质量值（如Phred值）来衡量，Q30表示碱基错误率为千分之一，高质量数据中Q30碱基比例应较高，如大于80%。

GC含量：正常范围的GC含量与物种基因组特征相符，若偏离过大，可能存在样本污染或实验偏差。

比对结果

比对率：即测序 reads能成功比对到参考基因组的比例，通常应在80%以上，过低可能是样本质量差或测序数据存在问题。

比对均匀性：观察基因组各区域的覆盖均匀程度，若存在大片段低覆盖或高覆盖区域，可能影响变异检测准确性。

变异检测

变异数量与类型：合理的变异数量应符合生物学常识和研究对象特点，同时关注变异类型是否符合预期，如单核苷酸变异（SNV）、插入缺失变异（InDel）等比例是否正常。

变异验证：通过Sanger测序等方法对部分变异位点进行验证，验证成功率越高，结果可靠性越强。

细胞异质性分析

聚类分析：通过聚类分析能识别不同细胞亚群，若聚类结果清晰且符合生物学预期，表明实验结果能有效反映细胞间异质性。

基因表达相关性：分析基因表达的相关性，若细胞间基因表达相关性合理，说明实验结果能准确呈现细胞的生物学状态。

本篇文章对科研爱好者有一定参考价值。但它不能替代专业领域更详尽、精准且深入的专业知识体系，也不等同于实际实验操作流程。若阅读时发现侵权或争议内容，请立即联系作者删除，以保文章合法性与合规性，维护良好科研交流环境。

参考文献

[1] 张成鹏.单细胞测序技术及其应用综述[J].河南科学,2022,40(09):1390-1397.

[2] 杨奕璇.人类单细胞全基因组测序数据库的构建[D].东南大学,2022.DOI:10.27014/d.cnki.gdnau.2022.002907.

[3] 潘星华,朱海英,MARJANI Sadie L..单细胞基因组学分析的技术前沿[J].遗传,2011,33(01):17-24.