【百欧泰生物】大肠杆菌蛋白表达：开启生物科研与制药新征程

大肠杆菌蛋白表达是现代生物技术领域的关键技术。它借助大肠杆菌繁殖迅速、遗传背景清晰且易于培养等特性，成为生产重组蛋白的常用手段。其原理是将外源基因导入大肠杆菌，利用其细胞机制合成目标蛋白。通过构建合适的表达载体，转化至大肠杆菌细胞内，经发酵培养后，再把表达的蛋白纯化出来。在生物制药中，许多药用蛋白如胰岛素等都借此技术大规模生产，为医疗健康事业提供了充足的药物资源，有力推动了生命科学研究与产业发展。

大肠杆菌蛋白表达：从基因到纯蛋白的精细构建

1. 基因克隆与载体构建：首先获取目的基因，可从基因文库筛选、人工合成或 PCR 扩增。接着依据需求选表达载体，如考虑蛋白可溶性、分泌性及启动子类型等。然后对载体与目的基因双酶切，再用连接酶连接。将连接产物转化入感受态大肠杆菌，通过抗生素筛选阳性克隆，最后经酶切和测序鉴定重组载体，确保目的基因正确插入且序列无误。

2. 大肠杆菌转化：将构建好的重组载体转入感受态大肠杆菌细胞，如常用的E.coli BL21(DE3)。取50-100μL 感受态细胞与1-5μL重组质粒轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，迅速放回冰中冷却2-5分钟，加入500-1000μL SOC培养基，37℃、200-250 rpm振荡培养1-2小时。

3. 筛选与鉴定：将转化后的菌液涂布在含有相应抗生素的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16小时，挑取单菌落进行菌落PCR或质粒提取后酶切鉴定，以确认重组质粒是否成功转入大肠杆菌。

4. 小规模发酵培养：挑取鉴定正确的单菌落接入5-10 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37℃、200-250 rpm 振荡培养过夜。然后按1%-5%的接种量转接至50-500 mL新鲜的LB或其他优化后的培养基中，在 37℃、200-250 rpm下培养至对数生长期。

5. 蛋白诱导表达：加入终浓度为0.1-1 mM 的IPTG（异丙基-β-D -硫代半乳糖苷）进行诱导，诱导温度可根据蛋白特性选择，一般为16-37℃，诱导时间4-24小时，期间持续振荡培养。

6. 细胞收集与破碎：诱导结束后，4℃、5000-8000 rpm 离10-20分钟收集菌体。用预冷的缓冲液（如 PBS，pH 7.4）重悬菌体，采用超声破碎或高压匀浆等方法破碎细胞。超声破碎时，工作3-5秒，间歇5-10秒，总时长5-10分钟，功率200-400W。

7. 蛋白纯化：可采用亲和层析法。通过逐步洗脱和收集，得到较纯的目标蛋白，最后利用SDS-PAGE等方法检测蛋白纯度和浓度，以确定最终获得的蛋白产量和质量。

大肠杆菌蛋白纯化的问题和解决方案

1. 蛋白表达量低可能源于载体构建不佳或诱导条件不适宜。解决方法是优化载体，如选择强启动子，同时精准调控诱导剂浓度、温度与时间等诱导参数。

2. 杂质含量高也较为常见，包括宿主蛋白、核酸等杂质。可采用多步纯化策略，如先通过离子交换层析去除大部分带电杂质，再结合凝胶过滤层析按分子大小分离目标蛋白与剩余杂质。蛋白变性与聚集现象时有发生，这多是因为纯化环境不当。需严格控制缓冲液的 pH 值、离子强度与添加剂（如甘油可防聚集），并在低温环境下操作。

3. 蛋白活性丧失可能与纯化过程中蛋白酶的作用有关。添加蛋白酶抑制剂，优化纯化流程以缩短操作时间，可有效维持蛋白活性，从而提升大肠杆菌蛋白纯化的成功率与蛋白质量。

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参考文献

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