动物模型与评估丨脆性X综合征小鼠行为评估

重点推荐

单粒种子抓取实验（Single-pellet reaching task）

选取2月龄雄性小鼠限制进食，保持其体重的90%。将小鼠放置在由亚克力材质制造的透明盒子里（长15cm，宽8.5cm，高20cm），盒子前壁上有一条垂直的狭缝(宽0.5cm)，单个可触及的种子颗粒放置于狭缝外高1.25cm的平台上。在没有放置种子颗粒的情况下，放置小鼠于盒子里15分钟，第二天再进行实验。实验分为两个阶段：塑型和训练。

（1）塑形

在塑形阶段时，小鼠伸出任意前肢抓取塑形盒外的种子颗粒，记录小鼠偏好前肢。当小鼠用单一前肢抓取种子颗粒概率达到70%以上（总抓取次数≥20次）时，无论是否成功抓取种子颗粒，均判定该前肢为小鼠偏好前肢，可进入下一阶段训练，反之则第二天继续塑形实验。连续5天塑形失败者即可淘汰。

（2）训练

在训练阶段时，将单粒种子放在塑形笼狭缝外相应偏好前肢的对侧位置，使小鼠能够使用偏好前肢通过狭缝顺利抓取种子颗粒。视频记录小鼠20分钟内偏好前肢抓取种子颗粒30次，通过慢动作视频监控将抓取行为精度分为4类：1）成功：小鼠使用偏好前肢通过狭缝，使爪子覆盖于种子颗粒上，且将种子颗粒抓回吞食；2）错失：小鼠使用偏好前肢通过狭缝，但爪子未触到种子颗粒；3）未抓住：小鼠使用偏好前肢通过狭缝，爪子接触到种子颗粒，但没有正确抓住；4）掉落：小鼠使用偏好前肢通过狭缝，爪子接触到种子颗粒且正确抓住，但在将其送入口中之前掉落。连续训练8天，统计每天抓取的成功率。

平衡木实验（Beam walking）

将小鼠放在距离地面高度为50cm的平衡木一端，使其沿着平衡木爬行至远端，远端为长30cm宽30cm的长方形停靠区域，记录小鼠成功抵达远端停靠区域的时间和途中的滑脚次数。在正式实验的前一天，让小鼠提前适应平衡木，将小鼠放在起始点，触碰小鼠尾部促使其往终点爬行，每只小鼠训练3次，同一只小鼠每次训练间隔时间≥5分钟，3次均完整爬行到终点视为学习成功。测试时，将小鼠放在起始点，记录其爬行到终点的时间，此过程中训练者不触碰小鼠，小鼠停下时暂停计时，继续爬行时则继续计时，若小鼠掉头往起点爬行，则需重新测试。每只小鼠需测试3天，每天3次，通过平衡木所需时间和滑脚次数最终取所有成绩的平均值。

旋转棒实验（Accelerating Rotarod）

小鼠在测试前一天使用旋转棒装置进行适应，小鼠被放在以每分钟4rpm旋转的旋转棒上，最长时间为5分钟。如果小鼠在适应当天未能在旋转棒上停留超过30秒，或者在接下来的几天故意从转杆上跳下来，则淘汰它们。训练阶段时，小鼠被放在转棒上，初始转速为4rpm，在5分钟内加速到40rpm，直到小鼠从旋转棒上掉落，则本轮实验结束。每天3轮训练，每轮训练间隔至少5分钟，连续3天，记录小鼠最终掉落时的终末速度。

旷场实验（Open Field Task）

通过旷场实验评估小鼠的运动能力，实验前，需先将小鼠放置行为学房间适应2天。行为学房间为一个隔音房间，并且光线昏暗，以降低小鼠焦虑水平。正式实验时，在一个正方形底部(72cm×72cm)的反应箱内，测试小鼠轻轻放置在中心区域，视频记录5分钟内测试小鼠的活动情况，包括总路径长度和运动速度。每次测试结束后，用75%的酒精清洁场地，清除上一只小鼠残留的气味，避免影响下一只小鼠的运动监测。

Fig1 单粒种子抓取实验检测小鼠前肢运动控制学习能力

钙信号记录

在小脑内侧核、间位核定位注射AAV-ef1a-dio-GCaMP6，待2周后在外侧脑区埋置陶瓷插针，利用牙科水泥固定，一周后，通过三色多通道光纤记录系统探测清醒活动的小鼠的小脑深部核团在完成运动技能学习时神经元的活动情况。当自由活动的小鼠准备运动时，荧光信号显著上升，表明该通路被激活。

埋置陶瓷插针：参照脑立体定位注射的步骤实施开颅手术，并用3％双氧水将颅骨表面的组织彻底清理。调平颅骨，使前后囟位于同一水平面，在颅骨表面定位光纤的记录位点，钻孔开颅，孔径0.6-0.8mm，挑除孔底颅骨薄片与硬脑膜。将光纤置于皮层表面定为零点，然后将光纤缓慢插入脑内，直至目标脑区上方50nm处停止，用牙科水泥将光纤固定于颅骨表面。手术结束后，待小鼠清醒将其转入饲养笼中，并给予食物和水。小鼠恢复1周后，记录其在行为中自由活动时小脑目标脑区的Ca2+活动，同时用高清摄像机同步采集行为学数据，持续记录不超过10min。

为了进一步观察DCN脑区神经元如何参与小鼠运动技能学习行为，使用在体光纤记录监测DCN神经元活动。光纤记录是通过记录群体神经元荧光信号强弱来体现神经元的群体活性变化。将监测小鼠脑区注射rAAV-hSyn-GCaMp6f-WPRE-hGH，等待小鼠术后恢复2周后，给小鼠埋上光纤，小鼠恢复状态后连上设备，监测小鼠进行运动技能学习任务时相应脑区的钙信号

活动。在平衡木实验中，先让小鼠通过宽10mm、长80cm的平衡木，记录小鼠由运动前1s的静止状态至运动起始后2秒的运动状态时Int脑区神经元钙信号活动。结果显示，两组小鼠自运动起始后Int脑区钙信号均增强。通过计算运动起始后2秒时期的曲线下面积，评估小鼠脑区神经元钙信号活动。

Fig3 Fmr1 KO小鼠通过10mm宽平衡木时Int脑区神经元钙信号活动

图A-B：(A)上图为小鼠Int脑区神经元平衡木上运动时的钙信号变化热度图，下图为小鼠进行平衡木实验钙信号变化事件相关的线图平均值，黑色虚线表示小鼠运动起始，(B)4只不同小鼠分别进行2次平衡木实验钙信号统计图。