斑马鱼行为篇㉛：浅析斑马鱼氧化应激

氧化应激引起的氧化损伤与机体的很多疾病有重要关系，而抗氧化是预防衰老和抵抗各种疾病很重要的一环。因而需要一种能够快速、高效、廉价的动物模型，从各方面来比较，斑马鱼无疑是实验动物的最佳选择。斑马鱼作为一种新兴的模式生物，属于脊椎动物，因其具有繁殖周期短，三个月即可达到性成熟；体型小，体长3-4cm；易于饲养，生存能力强；产卵量大，一次可产数百枚卵；且其胚胎透明，能在体外快速发育，从而使斑马鱼在正常生长发育及外源化合物的处理下便于观察其发育进程的变化，成为最重要的模式脊椎动物之一。研究发现斑马鱼基因与人类基因组的同源性高达87%，并且与斑马鱼造血有关的转录因子与其他哺乳动物具有高度同源性，近年来，斑马鱼已大规模用于人类各类疾病的研究。采用斑马鱼作为实验动物，通过使用脂多糖（LPS）、(CH3COO)2Pb、AAPH三种诱导剂建立的斑马鱼氧化应激模型，比较三者诱导之后的斑马鱼胚胎体内的ROS、脂质过氧化程度、细胞死亡量等指标，并比较三个造模组的胚胎孵化率，得出最佳的造模方法，可为开展各种抗氧化实验和抗氧化药物的开发提供基本的实验模型。

实验动物为斑马鱼胚胎，胚胎由斑马鱼交配获得。成年斑马鱼的养殖条件为水温28°C，PH值为7.0～7.5，电导率为400～600μs/cm。每天喂养三次，日光灯照射14h，黑暗10h。

头天晚上18:00雌雄斑马鱼按1:1.5的比例用挡板隔开于鱼缸中，次日早晨8:00开灯拨掉挡板，斑马鱼受光刺激开始出现明显的“追尾”现象，9-10时就可以看到鱼缸底有圆形透明颗粒，这就是斑马鱼的受精卵。卵会由纱网漏到缸底，避免被鱼吃掉。产卵完毕后，将卵置于盛有人工海水的小培养皿里，放于28.5℃的恒温光照培养箱里培养。并于荧光显微镜下挑选3hpf（hours of postfertilization，hpf）发育正常的斑马鱼胚胎。

鱼卵随机分为空白对照组（NC）、AAPH组（AAPH）、LPS组（LPS）、醋酸铅组（(CH3COO)2Pb）。每组挑选25个发育正常的胚胎。每批的前期处理按如下步骤操作。将发育正常的7hpf斑马鱼胚胎置于盛有人工海水的24孔板里。每个造模组用对应的药物处理，LPS组的终浓度为1ppm，(CH3COO)2Pb组的终浓度为1.6·10-6ppm，AAPH组的终浓度为12.5mM，同时诱导14h。NC组为没有任何添加的人工海水。每组设三个重复。诱导结束后，每组胚胎的培养基换为新鲜的无其他添加的人工海水。一天后，同样更换培养基。数小时后，可看到胚胎已孵化为器官完整的小斑马鱼四处游动。紧接上面操作，此时开始对每组斑马鱼以20μg/mL的DCFH-DA探针处理，黑暗28.5℃下培养1h，1h后用人工海水淋洗数次，用0.02%三卡因麻醉后置于荧光显微镜下拍照，并计算其荧光强度；对每组斑马鱼以25μg/mL的DPPP处理每组斑马鱼，黑暗28.5℃下培养1h，1h后用人工海水淋洗数次，于荧光显微镜下拍照，并计算各组的荧光强度；以7μg/mL的AO探针处理各组斑马鱼，黑暗28.5℃培养30min，之后以人工海水淋洗数次，接着于荧光显微镜下拍照，并计算荧光强度。

斑马鱼胚胎给药

挑选正常发育至7~9hpf的斑马鱼胚胎，以20枚/孔转移至24孔板中，去除旧培养液，每孔分别加入空白胚胎培养液（10%NaCl，0.3%KCl，0.3%CaCl2，0.79%MgSO4）、胚胎培养液配制的样品溶液或AAPH诱导溶液，培养体系为2mL培养液，每组设置三个平行对照孔，给药完成后置于（28.5±1）℃恒温培养箱中培养。对不同浓度AAPH（10、15、20、25、30mmol/L）诱导的斑马鱼氧化应激模型进行优化。待斑马鱼胚胎发育至8~9hpf时进行一次胚胎给药，置于（28.5±1）℃培养箱中培养，后续分别进行斑马鱼胚胎存活率、卵黄囊大小、幼鱼体内ROS生成率及细胞死亡率的检测。SFPS毒性评价：选择一定浓度（50、100、200、400μg/mL）SFPS进行毒性评价实验，于胚胎发育的7~8hpf加入样品，其后置于（28.5±1）℃培养箱中培养，进行斑马鱼胚胎存活率、正常发育率、心跳速率、幼鱼体内细胞死亡率的检测。

不同浓度AAPH对斑马鱼幼鱼体内细胞死亡率的影响

最佳的选择是以1ppm的LPS或者1.6·10-6ppm的(CH3COO)2Pb诱导斑马鱼胚胎14h，即可获得稳定、高效的斑马鱼氧化胁迫模型。

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参考文献

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2、王胜男,付晓婷,许加超,等.羊栖菜褐藻糖胶对AAPH诱导的斑马鱼氧化应激模型的保护作用[J].食品工业科技,2021,42(18):356-365.

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4、韩玉龙. 斑马鱼氧化应激模型优化及药根碱抗LPS介导的氧化应激机制研究[D].西南大学,2018.

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