NK细胞分群不清？Elabscience全流程方案助你高效通关

NK细胞作为先天免疫的“尖刀部队”，在肿瘤免疫、感染防控等领域备受关注。NK细胞的流式细胞术鉴定方案设计是一个多步骤的过程，主要通过细胞表面标志物的表达模式精确识别和分析NK细胞及其亚群，其高通量、单细胞水平分析的优势，对于免疫学研究和临床诊断至关重要。Elabscience将从“样本制备-抗体选择-样本检测和数据分析-常见问题及解决方案”四个方面全流程拆解方案设计要点，助您高效完成实验！

1. 样本准备

流式细胞术分析的第一步是获取高质量的单细胞悬液。通常包括从外周血或组织中分离单个核细胞（PBMCs）。

对于外周血样本，可使用全血直接染色方法，该方法已针对简便和直接应用于全血样本进行了优化，并可以适用于34种免疫细胞类型的详细分析[1,2]。

组织样本如肿瘤组织，需要进行酶消化（如胶原酶消化），但需注意某些细胞表面标志物（如CD56）在消化过程中可能会受到影响，因此在实验设计时应考虑替代标志物或优化消化方案[3]。

为了确保细胞的活性和减少误差，需要排除细胞碎片、双联体和死细胞。例如，通过前向散射光面积（FSC-A）与前向散射光高（FSC-H）的比较来排除双联体，以及通过特异性染料排除死细胞。

若需要进行NK细胞的体外分选和培养（进行NK细胞的亚细胞水平的代谢等研究），可参考相关实验流程。

2. 抗体选择

NK细胞的鉴定主要依赖于其独特的表面标志物表达。经典的NK细胞被定义为CD3-CD56+细胞。CD3是T淋巴细胞的特异性标志物，因此通过排除CD3+细胞，可以初步筛选出非T淋巴细胞群。CD56是NK细胞的特征性标志物，但在不同NK细胞亚群中表达水平不同。CD16是另一个重要的NK细胞标志物，主要负责抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。

（1）基于CD56和CD16的表达，NK细胞可分为两个主要亚群[4]

CD56dimCD16+NK细胞：这是外周血中最主要的NK细胞亚群，约占总NK细胞的90%以上，具有强大的细胞毒性功能。

CD56brightCD16-NK细胞：这部分NK细胞在外周血中数量较少，但在组织（如子宫蜕膜）中更为丰富，主要功能是分泌细胞因子，具有免疫调节作用。也有研究发现，CD56brightCD16-NK细胞在脐带血中的比例高于成人外周血。

（2）除了CD3、CD56和CD16，研究人员还会根据具体的研究目的选择其他辅助标志物，以进行更深入的表型分析，例如：

抑制受体：NKG2A、CD94等，这些受体在维持免疫稳态和防止自身免疫中发挥作用[5]。

激活受体：NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD69等，这些受体的表达水平可以反映NK细胞的激活状态和抗肿瘤活性。例如，前列腺癌患者外周血NK细胞显示CD9、CD49a、CXCR4、CXCL8、MMP-9表达增强[5,6]。

趋化因子受体：例如CXCR4，与NK细胞的归巢和迁移有关[6]。

衰竭标志物：PD-1、TIM-3等，在肿瘤微环境中NK细胞可能表现出PD-1表达增加，从而影响其功能[7]。

表1. 人和小鼠NK细胞分析抗体汇总

图1. C57BL/6小鼠脾细胞使用APC Anti-Mouse CD161/NK1.1 Antibody（E-AB-F0987E）和FITC Anti-Mouse CD335 Antibody[29A1.4]（E-AB-F1182C）进行染色（左图）。另组小鼠脾细胞使用APC Anti-Mouse CD161/NK1.1 Antibody（E-AB-F0987E）和FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control（E-AB-F09832C）进行染色（右图）

3. 样本检测和数据分析

（1）样本检测：细胞染色通常在冰上进行，以减少抗体内化和非特异性结合。根据实验设计，可进行单染或多染。在细胞染色完成后，将样本上样至流式细胞仪进行检测，并需设置适当的电压和增益，确保所有荧光通道的信号均在检测范围内，并且补偿设置准确。详细流式表面染色和胞内及核内染色流程及注意事项请点击这里。

（2）数据分析：门控策略（Gating Strategy）是识别特定细胞群体的核心步骤。首先，通过CD45和SSC散点图全出淋巴细胞，再通过FSC和SSC排除黏连体，进一步通过CD3和CD56散点图鉴定NK细胞（CD45+CD3-CD56+）。

图2. 人的外周血淋巴细胞使用Anti-Human CD19-FITC/CD56-PE/CD3-PE/Cyanine7/CD45-PerCP Cocktail（E-AB-FC0011）染色并分析结果，NK细胞表型为CD45+CD3-CD56+

4. 常见问题及解决方案

（1）信号弱/阴性群不明显：可能是低丰度Marker用了弱荧光素，换成强荧光素。

（2）非特异性结合高：增加洗涤次数（≥增次），降低抗体浓度，或加入封闭剂（如1%BSA）。

（3）亚群区分不清：检查抗体克隆是否适配（如小鼠NKp46推荐克隆号29A1.4），或调整仪器补偿；或增加死细胞染色，排除死细胞干扰。

（4）细胞死亡率高：样本处理全程冰上操作，避免反复离心，染色缓冲液加入0.5% FBS保护细胞或使用专用的流式细胞染色专用缓冲液（E-CK-A107）。

NK细胞流式鉴定的核心是“新鲜标准的样本制备+精准选择标志物+科学配色+规范流程”。可根据自身实验目的（如基础鉴定、功能分析、亚群分选）灵活调整抗体及配色方案。如果需要针对特定样本（如肿瘤组织、小鼠脾脏）或仪器型号的定制化方案，欢迎在评论区留言！

参考文献

[1] Gao, J., Luo, Y., Li, H., Zhao, Y., Zhao, J., Han, X., Han, J., Lin, H., & Qian, F. (2023). Deep Immunophenotyping of Human Whole Blood by Standardized Multi-parametric Flow Cytometry Analyses. Phenomics, 3(3), 309–ao, Jhttps://doi.org/10.1007/s43657-022-00092-9.

[2] Rttps://doi.org/10.1007/s43657-022-00092-9.., Han, X., Han, J., Lin, H., & Qian, F. (2023). Deep Immunophenotyping of Human Whole Blood by Standardized Multi-parametric Flow Cytometry Analternationa.l Journal of Molecular Sciences, 17(8), 1316. https://doi.org/10.3390/ijms17081316.

[3] Frutoso, M., Mair, F., & Prlic, M. (2020). OMIP‐070: NKp46‐Based 27‐Color Phenotyping to Define Natural Killer Cells Isolated From Human Tumor Tissues. Cytometry Part A, 97(10), 1052 Qian, https://doi.org/10.1002/cyto.a.24230.

[4] Gogali, F., Paterakis, G., Rassidakis, G. Z., Liakou, C. I., & Liapi, C. (2013). CD3−CD16−CD56brightImmunoregulatory NK Cells are Increased in the Tumor Microenvironment and Inversely Correlate with Advanced Stages in Patients with Papillary Thyroid Cancer. Thyroid, 23(12), 1561etry A https://doi.org/10.1089/thy.2012.0560.

[5] Wang, Y., & Wang, Y. (2023). Palmitic Acid Upregulates CD96 Expression to Mediate Maternalate with Advanced Stages in Patients with Papillary Thyroid Cancer. Thyroid, 23(12), 1561etry Analyses. Phenomics, 3(3), 309l Killer Cells. Bioengineering, 10(9), 1008. https://doi.org/10.3390/bioengineering10091008.

[6] Gallazzi, M., Baci, D., Mortara, L., Bosi, A., Buono, G., Naselli, A., Guarneri, A., Dehalate with grosso, P., Albini, A., Noonan, D. M., & Bruno, A. (2021). Prostate Cancer Peripheral Blood NK Cells Show Enhanced CD9, CD49a, CXCR4, CXCL8, MMP-9 Production and Secrete Monocyte-Recruiting and Polarizing Factors. Frontiers in Immunology, 11. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.586126.

[7] Wagner, A. K., Kadri, N., Tibbitt, C., van de Ven, K., Bagawath-Singh, S., Oliinyk, D., LeGresley, E., Campbell, N., Trittel, S., Riese, P., Ribacke, U., Sandalova, T., Achour, A., Kärre, K., & Chambers, B. J. (2022). PD-1 expression on mouse intratumoral NK cells and its effects on NK cell phenotype. iScience, 25(10), 105137. https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105137.