# 激活环境
conda activate metagenome

# 安装新工具
# GUNC, Barrnap, tRNAscan-SE 是本次核心新工具
# Prokka 用于基因预测，是菌株异质性分析的前置步骤
# CMSeq 用于计算异质性
conda install -c bioconda -c conda-forge gunc barrnap trnascan-se prokka cmseq -y

# GUNC 需要下载专用数据库，首次使用前必须运行
gunc download_db

输入文件

精炼后的 MAGs 目录: S1_BINNING/BIN_REFINEMENT/metawrap_50_10_bins/ (来自上一篇教程宏基因组进阶：从 Contigs 到高质量基因组草图 (MAGs) 的分箱实战)
原始 Clean Reads: S1_clean_R1.fq.gz 和 S1_clean_R2.fq.gz (用于菌株异质性分析)

步骤一：基础质控与嵌合体检测 (CheckM + GUNC)

这一步是质控的“守门员”，旨在快速过滤掉不合格的 MAGs。

软件作用

CheckM: 我们在上一篇教程中已经用过它，这里再次强调其作为评估完整度 (Completeness) 和污染度 (Contamination) 的金标准地位。
GUNC (Genes of Unexpected Normality for Contamination): 这是一个非常重要的补充工具。CheckM 主要关注单拷贝基因，但可能无法有效识别嵌合体 (Chimerism)——即一个 MAG 中错误地包含了来自不同分类单元（如不同门）的 Contigs。GUNC 通过评估 MAG 内所有基因的分类一致性来检测这种跨域污染，能有效剔除看似合格但实则“缝合怪”的 MAGs。

软件用法

我们假设 CheckM 已经运行完毕。接下来对通过 CheckM 初筛的 MAGs 运行 GUNC。

# 对整个 MAGs 目录运行 GUNC
gunc run --input_dir S1_BINNING/BIN_REFINEMENT/metawrap_50_10_bins/ \
         --out_dir S1_GUNC_QC \
         --threads 24

# 参数解释:
# --input_dir: 包含所有 MAGs (.fa 或 .fna) 的目录。
# --out_dir: 输出结果目录。
# --threads: 线程数。

运行结束后，查看核心输出文件 S1_GUNC_QC/GUNC_output.tsv。关注 pass.gunc 这一列，值为 TRUE 的 MAGs 才算通过了嵌合体检测。只有同时满足 CheckM 标准和 GUNC 检测的 MAGs，才能进入下一步。

步骤二：结构完整性评估 (rRNA & tRNA)

软件作用

根据 MIMAG 标准，一个高质量 (High-quality) 的 MAG 不仅要满足 >90% 完整度和 <5% 污染度，还必须包含完整的 rRNA 操纵子（5S, 16S, 23S rRNA）和至少18种不同的 tRNA。这证明了基因组组装的连续性和结构的完整性。

Barrnap: 快速、准确地从基因组中预测 rRNA 基因。
tRNAscan-SE: 识别 tRNA 基因的权威工具。

软件用法

我们需要为每个通过第一步筛选的 MAG 单独运行这两个工具。这里以一个 MAG (bin.1.fa) 为例，你可以编写一个简单的循环脚本来处理所有 MAGs。

MAG_FILE="path/to/bin.1.fa" # 替换为你的 MAG 文件

# 1. 预测 rRNA
barrnap --threads 8 --outseq bin.1.rRNA.fa ${MAG_FILE} > bin.1.rRNA.gff

# 2. 预测 tRNA
tRNAscan-SE -o bin.1.tRNA.out -g general.gff ${MAG_FILE}

# 结果解读：
# - 查看 bin.1.rRNA.gff 文件，检查是否同时包含 5S_rRNA, 16S_rRNA, 23S_rRNA。
# - 查看 bin.1.tRNA.out 文件，看识别出的 tRNA 种类是否 >= 18 种。

步骤三：菌株异质性评估 (CMSeq)

软件作用

在宏基因组中，一个物种可能由多个遗传上略有差异的菌株组成。如果我们的 MAG 混合了多个菌株的序列，它实际上是一个“种群共有基因组”，而不是单个菌株的基因组。高菌株异质性 (Strain Heterogeneity) 会干扰后续的 SNP 分析和代谢通路重建。CMSeq 是一个专门用于评估 MAGs 菌株异质性的工具。它通过计算**种内多态性 (Intra-population Polymorphism)**，即在单拷贝核心基因上的核苷酸多样性（π），来量化异质性程度。

软件用法

这是一个多步流程，需要先将 reads 比对回 MAG，然后进行变异检测。

MAG_FILE="path/to/bin.1.fa" # 目标 MAG
THREADS=24

# 1. 基因预测 (CMSeq 需要基因位置信息)
prokka --outdir bin.1_prokka --prefix bin.1 --cpus ${THREADS} --quiet ${MAG_FILE}
GFF_FILE="bin.1_prokka/bin.1.gff"

# 2. 比对 reads 到 MAG
bwa index ${MAG_FILE}
bwa mem -t ${THREADS} ${MAG_FILE} S1_clean_R1.fq.gz S1_clean_R2.fq.gz | \
  samtools view -bS -F 4 - | \
  samtools sort -o bin.1.sorted.bam -

samtools index bin.1.sorted.bam

# 3. 运行 CMSeq
cmseq --threads ${THREADS} polymut --bam bin.1.sorted.bam --gff ${GFF_FILE} --output bin.1.polymut.tsv

查看输出文件 bin.1.polymut.tsv。其中 mean_SNV_frequency 或相关的核苷酸多样性指标，可以用来评估异质性。通常，一个值很低（如 < 0.01）表示该 MAG 代表了一个相对单一的菌株群体。

总结与展望：构建你自己的参考数据库

通过以上层层筛选，现在拥有了一批高质量、高可信度的 MAGs。

最后一步，也是最重要的一步，是为这些 MAGs 建立一个标准化的比较背景。需要从公共数据库（如 NCBI RefSeq）下载相关的参考基因组，并对它们执行完全相同的质控流程（CheckM, GUNC 等），确保你的 MAGs 和参考基因组是在同一标准下进行比较的。

完成这一步后，就可以进入最终的分析阶段：

物种分类鉴定 (GTDB-Tk)
功能注释 (eggNOG-mapper, KOFAMscan)
比较基因组学分析

最终分析阶段我们下一节分享。

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原始发表：2025-09-25，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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