宏基因组进阶：从 Contigs 到高质量基因组草图 (MAGs) 的分箱实战
宏基因组进阶：从 Contigs 到高质量基因组草图 (MAGs) 的分箱实战
学习技能（点击标题跳转）
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在上一篇教程中宏基因组组装实战教程 (MEGAHIT + BBMap + BWA)，我们成功将测序 reads 组装成了 contigs，并计算了它们的覆盖深度。现在，我们将进入宏基因组分析中最激动人心的环节之一：基因组分箱 (Genome Binning)。分箱的目标，就是将成千上万条来源混杂的 contigs，根据其序列特征和丰度信息，重新聚类成属于单个物种的基因组草图（Metagenome-Assembled Genomes, MAGs）。
本教程将介绍一套业界领先的、基于 metaWRAP 的自动化分箱、整合与评估流程：
- 多工具并行分箱: 同时调用 MetaBAT2, MaxBin2, CONCOCT 三大主流工具。
- 分箱结果整合与精炼: 利用 Bin_refinement 模块，取长补短，生成更优的 MAGs。
- 基因组质量评估: 使用 CheckM 对 MAGs 的完整度和污染度进行权威评估。
准备工作：环境与输入文件
环境部署
metaWRAP 是一个强大的流程整合工具，但依赖项较多。同样，我们强烈建议使用 Conda 进行一站式安装。
# 激活我们之前创建的环境
conda activate metagenome
# 安装 metaWRAP (它会自动处理 MetaBAT2, MaxBin2, CONCOCT, CheckM 等依赖)
conda install -c ursky metawrap-mg -y
# 关键一步：配置 metaWRAP 依赖的数据库
# 这个过程会下载 NCBI_nt/taxdump 等数据库，需要较长时间和网络
# 请确保你有足够的磁盘空间（~50GB）
metawrap-get_dbs
输入文件
本教程需要上一篇教程的两个输出文件：
● 组装好的 Contigs: S1_megahit_out/final.contigs.fa
● Contigs 覆盖度文件: S1_contig_depth.txt
步骤一：metaWRAP 多工具并行分箱
软件作用
不同的分箱软件基于不同的算法，各有优劣。例如，MetaBAT2 对四核苷酸频率敏感，而 CONCOCT 则擅长利用覆盖度信息。单独使用任何一种工具都可能得到次优的结果。
metaWRAP 的 binning 模块 可以一键并行运行这三款软件，并将它们的原始分箱结果分别存放在独立的文件夹中。这种“集思广益”的策略是获得高质量 MAGs 的第一步。
软件用法
# 定义输入文件变量
CONTIGS="S1_megahit_out/final.contigs.fa"
DEPTH_FILE="S1_contig_depth.txt"
THREADS=24
# 运行 metaWRAP binning 模块
metawrap binning \
-o S1_BINNING \
-t ${THREADS} \
-a ${CONTIGS} \
--metabat2 --maxbin2 --concoct \
S1_clean_R1.fq.gz S1_clean_R2.fq.gz
# 参数解释:
# -o: 指定总的输出目录。
# -t: 使用的线程数。
# -a: 输入的 contigs 文件。
# --metabat2 --maxbin2 --concoct: 指定要运行的三款分箱软件。
# 最后两个参数是原始的 clean reads，metaWRAP 会自动处理比对和深度计算。
# 注意：即使我们已手动计算深度，为保持流程统一，metaWRAP 仍建议提供 reads。
运行结束后，S1_BINNING/ 目录下会生成 metabat2_bins/、maxbin2_bins/ 和 concoct_bins/ 三个子目录，分别存放着三款软件的初步分箱结果。
步骤二：metaWRAP 整合与精炼分箱结果
软件作用
三套分箱结果通常存在差异。metaWRAP 的 Bin_refinement 模块 会比较这三套结果，通过一种投票或共识算法，生成一个杂合的、质量更高的最终分箱集。它会剔除冲突的 contigs，合并一致的 bins，最终得到一套优化后的 MAGs。
我们使用 -c 50 和 -x 10 参数，这直接对应了国际公认的 MIMAG (Minimum Information about a Metagenome-Assembled Genome) 标准中的“中等质量”基因组草图门槛（完整度 > 50%，污染度 < 10%）。
软件用法
# 运行 metaWRAP Bin_refinement 模块
metawrap bin_refinement \
-o S1_BINNING/BIN_REFINEMENT \
-t ${THREADS} \
-A S1_BINNING/metabat2_bins/ \
-B S1_BINNING/maxbin2_bins/ \
-C S1_BINNING/concoct_bins/ \
-c 50 \
-x 10
# 参数解释:
# -o: 指定精炼结果的输出目录。
# -A, -B, -C: 分别指定三款软件的原始分箱结果目录。
# -c: 最小完整度 (Completeness) 阈值，设为 50%。
# -x: 最大污染度 (Contamination) 阈值，设为 10%。
完成后，在 S1_BINNING/BIN_REFINEMENT/metawrap_50_10_bins/ 目录下，你将找到精炼后并经过初步筛选的 MAGs 文件（以 .fa 结尾）。
步骤三：使用 CheckM 进行最终质量评估
软件作用
CheckM 是评估 MAGs 质量的“金标准”。它通过检测物种特异性的单拷贝核心基因（Single-Copy Core Genes）的出现情况，来精确估算每个 MAG 的完整度 (Completeness) 和 污染度 (Contamination)。
metaWRAP 的 quant_bins 模块封装了 CheckM，可以方便地对一批 MAGs 进行批量评估。
软件用法
# 运行 metaWRAP quant_bins 模块
metawrap quant_bins \
-o S1_BINNING/QUANT_BINS \
-t ${THREADS} \
-b S1_BINNING/BIN_REFINEMENT/metawrap_50_10_bins/
# 参数解释:
# -o: 指定质量评估结果的输出目录。
# -b: 输入的精炼后 MAGs 所在目录。
# -t: 线程数。
专业提示: 表格中提到的 CheckM -quick 参数会使用预筛选的、更小的标记基因集，速度更快，适合初步探索。而 metaWRAP 的 quant_bins 默认运行的是 CheckM 的 lineage_wf 完整流程，结果更精确，是发表论文时的推荐选择。
评估完成后，打开 S1_BINNING/QUANT_BINS/bins_qa.tsv 文件，你将看到一个清晰的表格，列出了每个 MAG 的完整度、污染度和菌株异质性等关键信息。
bin Completeness Contamination Strain heterogeneity ...
metawrap_50_10_bins.1 98.5 1.2 0.0 ...
metawrap_50_10_bins.2 92.1 3.5 15.2 ...
metawrap_50_10_bins.3 75.4 0.0 0.0 ...
...
根据这个表格，你可以轻松筛选出**高质量 MAGs (Completeness > 90%, Contamination < 5%) 和中等质量 MAGs (Completeness > 50%, Contamination < 10%)**，用于后续的物种注释、功能分析和比较基因组学研究。
总结
通过 metaWRAP 的“三部曲”，我们高效地完成了从混合 contigs 到高质量、已评估的微生物基因组的重建过程。现在，你手中这些 MAGs 就像是从复杂的微生物暗物质中发掘出的宝藏，等待着你去揭示它们的身份和秘密！
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