细胞聚类分群及其可视化

生信技能树jimmy

发布于 2024-06-13 18:23:17

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发布于 2024-06-13 18:23:17

文章被收录于专栏：单细胞天地单细胞天地

前情提要

在上一期单细胞PCA降维结果理解中给大家介绍了PCA降维，以及如何理解我们得到的降维结果。

那在单细胞基本分析流程中，使用RunPCA()进行了单细胞数据进行了线性降维，那接下来基于降维结果，对细胞进行聚类分群

需要用到的主要是FindNeighbors()以及FindClusters()两个函数，那这期就一起来了解一下单细胞的聚类分群叭！

FindNeighbors及FindClusters简介

细胞聚类的目标是根据细胞中各个基因表达模式的相似性（或距离）将一组细胞分组变成大类，使得这些大类成为有数学意义的亚群

seurat包中应用了一种基于图的聚类方法:

第一步: 根据 PCA 空间中的欧几里得距离构建一个k-最近邻（KNN，k-nearest neighbor）图，并根据任意两个单元格的局部邻域共享重叠——共享最近邻（SNN，shared nearest neighbor）细化任意两个单元之间的边权重两步来组成。使用函数FindNeighbors()执行
第二步: 应用模块化优化技术,默认使用Louvain算法来实现，在图中挑选相似度最高的一群细胞作为一个细胞亚群。使用函数FindClusters()来实现

命令使用及参数介绍

Ⅰ FindNeighbors

sce <- FindNeighbors(sce, reduction = "pca",
                     dims = 1:15)

FindNeighbors的一般会选择三个参数：

object：输入经过降维后的数据
reduction：选择降维的方法，比如pca或umap
dim参数：选择多少个PCA的维度进行分析，也就是上一步PCA降维后我们依据肘部图选择的维度

返回的结果告诉我们，计算了最近邻图以及SNN，并将结果保存在graphs中

Ⅱ FindClusters

#设置不同的分辨率，观察分群效果
for (res in c(0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5,0.8,1)) {
  sce.all=FindClusters(sce.all, 
                       resolution = res, algorithm = 1)
}

FindClusters也是一般三个参数：

object：输入上一步返回的seurat数据
resolution参数：resolution是分辨率，与最后的分群数目有关的，值越大得到的分群数目会越多。
algorithm参数：模块化优化算法，1代表使用原始的Louvain算法

可以计算不同分辨率，结果会保存在metadata里面，可以查看计算一下不同分辨率得到的分群的数量

colnames(sce.all@meta.data)

> table(sce.all@meta.data$RNA_snn_res.1)

  0   1   2   3   4   5   6   7   8   9  10 
559 498 342 278 239 231 172 159 114  32  14 

> table(sce.all@meta.data$RNA_snn_res.0.8)

  0   1   2   3   4   5   6   7   8 
610 520 467 342 319 175 159  32  14

使用table()可以看到当前分辨率下的细胞分群及其中的细胞数量，也可以对不同分辨率的进行可视化，然后根据可视化结果去选择合适的分辨率

不同分辨率结果可视化

Ⅰ clustree树状图

使用聚类树（clustree ）可视化显示在多个分辨率下分群之间的关系，可以看到样本随着分群数量的增加而变化的情况

clustree(sce.all@meta.data, prefix = "RNA_snn_res.")

clustree里面也有一系列的参数可以进行选择,在clustree ：聚类可视化利器[1]中周运来老师就有详细介绍

因为使用的是pbmc3k的示例数据，里面有注释结果，所以参考周老师整理的代码，可视化一下不同分辨率下分群与之的匹配程度

sce.all=FindClusters(sce.all,  
                     resolution = c(seq(0,1.6,.2)), algorithm = 1)

label_position <- function(labels) {
  if (length(unique(labels)) == 1) {
    position <- as.character(unique(labels))
  } else {
    position <- "mixed"
  }
  return(position)
}

clustree(sce.all@meta.data, prefix = "RNA_snn_res.", node_label = "seurat_annotations",
         node_label_aggr = "label_position")

从结果可看到不同的分辨率下细胞亚群分类的情况，一般比较常用的分辨率是0.1、0.5、0.8，如果选择低分辨率比如0.1就会将细胞分成，如果选择0.5或者0.8较高的分辨率就可以对细胞进行细分比如将CD4T分为Naive和Memory CD4T

Ⅱ 桑基图

除了聚类图外，另一种比较常用的细胞聚类可视化的方法是桑基图

#安装加载需要的R包
install.packages("ggalluvial")
library(ggalluvial)
library(tidyverse)

#基于metadata里面不同的分辨率绘制桑基图
head(sce.all@meta.data)
ggplot(data = sce.all@meta.data,
       aes(axis1 = RNA_snn_res.0.2, axis2 = RNA_snn_res.0.4,axis3 = RNA_snn_res.0.6,axis4 = RNA_snn_res.0.8,
           axis5 = RNA_snn_res.1,axis6 = RNA_snn_res.1.2)) +
  scale_x_discrete(limits = c(paste0("res.",seq(.2,1.2,.2))), expand = c(.01, .05)) +
  geom_alluvium(aes(fill = RNA_snn_res.1.2)) +
  geom_stratum() + geom_text(stat = "stratum", infer.label = TRUE) +
  #coord_polar()+
  theme(axis.text.x = element_text(angle = 90, hjust = 1))+
  ggtitle("cell number in each cluster")

基于桑基图的结果，我们可以看到中间分辨率下细胞亚群的来源以及可能的分群去向。

同样桑基图也可以选择不同的参数，展示不同的内容，桑基图在单细胞数据探索中的应用[2]中也给出了更加详细的介绍

Ⅲ balloonplot

也可以使用balloonplot简单可视化一下两个resolution中的细胞分群情况

gplots::balloonplot(table(sce.all$RNA_snn_res.0.2,sce.all$RNA_snn_res.0.8))

可以看到在0.2下的0群提高分辨率后变为0.8中的0和1两个群，2群变为4和6两个群，与聚类树中的结果一致

不同PCA维度的细胞聚类区别

在上一期单细胞PCA降维结果理解结尾中提到，可以使用肘部图去选择合适的维度（FindNeighbors中的dims参数）

#dims=1:15

sce <- FindNeighbors(sce, reduction = "pca",
                     dims = 1:15) 
sce.all=sce

sce.all=FindClusters(sce.all,  
                     resolution = 0.5, algorithm = 1)

DimPlot(sce.all,reduction = 'umap',label = T,repel = T)

sce2 <- FindNeighbors(sce, reduction = "pca",
                     dims = 1:30) 
sce.all2=sce2

sce.all2=FindClusters(sce.all2,  
                     resolution = 0.5, algorithm = 1)

DimPlot(sce.all2,reduction = 'umap',label = T,repel = T)