生信马拉松 Day8 GEO数据分析课程笔记

今天又是干货满满的一天！

本日的主要内容是梳理GEO数据库分析的流程，一图总结如下：

来自：生信技能树，生信马拉松，小洁老师

广义的基因有6w+个，包括lncRNA、miRNA等等，每年可能都有个别基因增增减减的情况，累计在一起，就存在基因库版本的差异，10年前查到的和今年的可能不一样，所以旧的数据仍然可以有新的解释，同一个数据集也可以在和其他数据集用不同的思路分析

我们的分析目的：寻找患者和对照组之间基因表达量差异

数据从哪来

来自：生信技能树，生信马拉松，小洁老师

当数据分析能力到达一定程度，来源就只是来源，不影响分析的步骤

有什么类型的数据可挖掘

基因表达芯片、转录组、单细胞

共同特点：都是为了获取每个样本里基因的表达量多少（除了单细胞）

转录组相对高级，但是都照样用，原理和分析步骤略有差别

单细胞的分辨率更高，一列不再是样本而是细胞，因此用个人计算机处理可能存在算力不足的情况

当然生信不只是表达量数据，只是我们学习时往往从表达量开始

其他可以研究的内容包括但不限于：突变、表观

最后目标是筛选和我目标疾病相关的差异表达的基因

数据分析的步骤

可以只做差异分析，也可以只做WGCNA，也可以都做取交集，主要是看得到的基因是否具有可解释性

常见图表

1.热图+聚类

输入数据是数值型矩阵/数据框

颜色的变化表示数值的大小

聚类默认是层次聚类，算法可以调整。算法不同可以让模棱两可内容结果发生差别，但不会让风马牛不相及的数据聚类在一起

相关性热图（相关系数在-1~1之间，你大我也大的关系，在0附近表示没有相关）

来自：生信技能树，生信马拉松，小洁老师

一般不画全部基因的热图，原因如下：

1.数据太大，画起来太费计算资源

2.没有必要，几万个基因里只有几十个到几千个表达存在差异，其余没有差异，如果全画，肉眼难以看到差别

2.散点图和箱线图

箱线图：输入数据是一个连续型向量和一个有重复值的离散型向量（分类型）

来自：生信技能树，生信马拉松，小洁老师

注意：箱线图的最大最小值有自己的计算方法，不是实际的最大最小值，最大最小值外可能存在离群值

箱线图适合展示一组数据的整体分布情况

5条线集中在一起，说明重复性好，数据集中

箱线图的实际用途：展示单个基因在两组之间的表达量差异

分组信息往往是单独提供的向量，注意需要分组信息和样本名一一对应

不一定需要先control、treat，但是分组一定要对应正确

3.多基因差异分析——火山图

来自：生信技能树，生信马拉松，小洁老师

横坐标是logFC，纵坐标是-log10(P.value)

Foldchange(FC)：处理组表达量平均值/对照组平均值

logFoldchange:FC取log2

芯片差异分析的起点是一个取过log的表达矩阵，如果拿到的是未log的矩阵，需要自行log

来自：生信技能树，生信马拉松，小洁老师

FC是对log后的数据取mean，mean(处理)-mean(对照)，否则反了全错

logFC到达4和5已经是很大了，实际表达值差异已经是16倍和32倍

Inf是正无穷

一般logFC的范围在火山图是±10以内

取过log的数据，一般是在0~20以内，没取log的矩阵，会出现几千几百的数据

在火山图中，logFC>0，treat>control，基因表达量上升；logFC<0，treat<control，基因表达量下降

通常说的上调、下调基因是指表达量显著上升/下降的基因，也就是结合p值来看

每一次差异分析都需要界定阈值，是可以自己调的，阈值关系到差异基因大小

logFC的常见阈值：1/2/1.2/1.5/2.2/0.585=log2(1.5)

在基因数量特别少的时候，例如只用一条通路里的基因画火山图，可以不管logFC

p值常见取值：0.0001,0.001,0.01,0.1

p值越小，越有信心认为差异显著，-log10(P.value)越大

注意：研究的时候不会以对照组为主体，都是看treat组上调了还是下调了

4.主成分分析

PCA样本聚类图：每个点代表一个样本，没有量纲，距离越近相似程度越高

来自：生信技能树，生信马拉松，小洁老师

横纵坐标是主成分（也称为综合指标），每一个主成分由若干个基因组成

在数学中，要求前两个主成分对数据解释程度>90%，在生物学中这个数字不太重要，因为基因数量太多了一共几万个，PCA数据的结果很可能前3个加在一起也不够90%，所以一般不用管这个值

每个圆有一个比较大的中心点，是占位符，不是样本点，只有点没有圈也是正常的，此时代表样本量少

主成分分析，旨在利用降维的思想，把多指标转化为少数几个综合指标（即主成分）

实际用途：用于“预实验”，简单查看组间是否有差别

同一分组是否聚成一簇（组内重复好）

中心点之间是否有距离（组间差别大）

两个圈之间可以有重叠

GEO背景知识+表达芯片分析思路（首先学芯片的分析）

1.表达数据实验设计：通过基因表达量数据的差异分析和富集分析来解释生物学现象

有差异的材料——差异基因——找功能/找关联——解释差异，缩小基因范围

芯片有探针，转录组没有探针，探针的表达量代表基因的表达量，得到的是探针矩阵

探针是一组短的已知的核苷酸序列，探针对应的是什么基因是后续自己增加的

表达矩阵：行是探针id，少数时候是直接给基因，或者1,2,3,4，相应注释里也是1,2,3,4，列名为GSM样本编号

探针id最后需要转换为gene symbol

我们不关心单个样本，重要的是分组信息

数据分析需要的内容：

（1）数据范围：取过log，0~20之间，无异常值，如NA、Inf（这两个在GEO中不常见）负值（常见，需要处理），无异常样本（看箱线图确认）

（2）需要探针id注释：根据gpl编号查找；探针与基因之间的对应关系

（3）分组信息：同一个分组对应同一个关键词；顺序与表达矩阵的列一一对应；因子，对照组的levels在前

TIPS

如何在GEO中寻找自己感兴趣的数据？

注意：不要选择少于6个样本的数据（每组至少3个，满足最小重复）