FastQC | 对测序数据进行质控及质控报告解读

生信real

发布于 2022-08-18 09:04:52

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发布于 2022-08-18 09:04:52

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FastQC软件简介

FastQC可以对测序数据进行质控来评估测序质量的好坏。

本期将演示如何使用FastQC对二代测序数据进行质控以及对质控报告进行全方位的解读。

FastQC官网

http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc

FastQC软件安装

## conda安装
conda install -y fastqc

## 编译安装
# 下载软件
wget https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.9.zip
# 解压软件
unzip fastqc_v0.11.9.zip
# 进入软件目录
cd FastQC/
# 赋予软件可执行权限
chmod 755 fastqc
# 将软件添加到环境变量
vim ~/.bashc
PATH=/opt/biosoft/FastQC:$PATH
source ~/.bashrc

Tips:①wget无法下载时建议用浏览器下载后自行传入服务器；②手动安装软件时建议统一归入到一个文件夹便于管理；③将软件添加到环境变量时需要根据自己软件安装位置进行添加。

FastQC示例数据下载

# 创建data文件夹后进入，下载测试数据
mkdir data；cd data
wget https://sra-download.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra60/SRR/019431/SRR19897777
wget https://sra-download.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra72/SRR/019431/SRR19897633

若后续地址更新，原链接无法下载，建议自行到NCBI搜索下载

FastQC示例数据处理

# 将下载的测序文件添加.sra后缀，以便让fastq-dump识别
ls | while read i ;do mv $i $i.sra;done
# 将sra文件转化为fastq文件
fastq-dump --split-files SRR19897*

Tips：①wget下载的数据没有后缀，直接用fastq-dump处理会报错，因此需要对其重命名加上".sra"后缀；②"SRR19897*"中的"*"是正则表达式，表示"*"前面的元字符出现任意次数或不出现。在示例中表示SRR19897777.sra和SRR19897633.sra两个文件。③fastq-dump会将sra格式转化成fastq格式，示例SRR19897777.sra会被转化为SRR19897777_1.fastq和SRR19897777_2.fastq；SRR19897633.sra会被转化为SRR19897633_1.fastq和SRR19897633_2.fastq

FastQC常用参数

-o : 将输出文件存放在此文件夹中。此文件夹需要提前建立，否则不会生成结果文件。不设置此参数，默认将结果文件输出到输入文件所在文件夹；
-f : 指定输入文件的格式。格式有：bam，sam,bam_mapped,sam_mapped,fastq；
-t : 并行计算最大任务数。

FastQC使用案例

mkdir fastqc_out
fastqc -t 2 -f fastq -o fastqc_out/ SRR19897*

FastQC主要结果文件

# FastQC主要结果文件
SRR19897633_1_fastqc.html  
SRR19897633_2_fastqc.html  
SRR19897777_1_fastqc.html  
SRR19897777_2_fastqc.html

FastQC会为每个输入文件生成一个以html为后缀的网页型结果，下面将以SRR19897633_1_fastqc.html为例带大家对质控结果进行解读

FastQC结果文件解读

质检报告提供了以下信息（绿勾合格，黄色叹号警告，红叉不合格）：①Basic Statistics、②Per base sequence quality、③Per sequence quality scores、④Per base sequence content、⑤Per sequence GC content、⑥Per base N content、⑦Sequence Length Distribution、⑧Sequence Duplication Levels、⑨Overrepresented sequences、⑩Adapter Content

①Basic Statistics

Basic Statistics：包括Filename（文件名）、File type（文件类型）、Encoding（测序平台）、Total Sequences（总序列数）、Sequences flagged as poor quality（低质量测序碱基数）、Sequence length（序列长度，给出最短和最长的序列长度，若是所有序列长度一致，则只给出一个值）和%GC（所有序列总的GC含量）。

②Per base sequence quality

Per base sequence quality：序列每个位点对应的碱基质量分布。x轴是测序reads的位点，y轴是碱基质量；红线表示中位数；蓝线代表平均质量。
示例数据中，序列碱基质量分布主要集中在绿色区域，表明测序质量很好。

③Per sequence quality scores

Per sequence quality scores：序列平均质量频数。x轴是平均碱基质量值，y轴是平均碱基质量值对应的reads数。如果频数最大的平均碱基质量值低于27，则统计结果为Warning；如果频数最大的平均碱基质量值低于20，则统计结果为Failure。
示例数据中，频数最大的平均碱基质量值在37左右的位置，表明测序质量很好。

④Per base sequence content

Per base sequence content：统计序列每个位点的碱基（ATGC）含量。如果有位点的A和T、或G和C的含量差异高于10%，则统计结果为Warning；如果有位点的A和T、或G和C的含量差异高于20%，则统计结果为Failure。
示例数据中，起始位置碱基波动严重，后续分析需要对该区间进行过滤。

⑤Per sequence GC content

Per sequence GC content：统计每个序列GC含量的频数。红色线是实际值，蓝色线是理论值。峰值位点对应着总体GC含量。红色线条的值和蓝色线条的值相比得到偏差值，所有位点偏差总和如果超出所有reads的15%，则统计结果为Warning；如果超出30%，则统计结果为Failure。
示例数据中测序数据GC含量和理论值差异较大，可能是由于测序偏向性（某特定区域会被反复测序）造成的。

⑥Per base N content

Per base N content：每个位点的N含量。如果有位点的N含量>5%，则统计结果为Waming；N含量>20%，则统计结果为Failure。
示例数据中N含量几乎为0，表明测序质量很好。

⑦ Sequence Length Distribution

Sequence length distribution：序列长度分布。如果所有的序列不是一样长度，则结果为Warning；如果有序列的长度为0,则为Failure。
示例数据中未见明显小片段reads，表明测序质量较好（Warning为正常现象）。

⑧Sequence Duplication Levels

Sequence Duplication Levels ：统计重复序列的含量。图中x轴为reads重复的次数: y轴为重复指次数对应的reads占unique reads的比例。序列重复比例越高，则表明实际有用的序列越少。如果序列重复水平值大于20%，则结果为Warning；重复水平值大于50%，则为Failure。
示例数据中重复序列水平值小于20%，测序质量很好。